[發明專利]病毒純化

有效

• 申請號: 201410244813.5
• 申請日: 2009-06-18
• 公開（公告）號: CN103993040B
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發明（設計）人: R.特魯蘭;R.巴克利;P.拉德克利夫;J.米斯金;K.米特羅法諾斯
• 申請（專利權）人: 牛津生物醫學(英國)有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 孔青,李炳愛

本申請為分案申請，原申請的申請號為200980132555.9，申請日為2009年6月18日，發明名稱為“病毒純化”。

發明領域

本發明涉及反轉錄病毒載體生產和純化的改進方法。

發明背景

基因治療技術的成功有賴于能夠以對人體安全的方式實現轉移的基因的充分表達。反轉錄病毒常常用作遞送系統(或者稱為遞送介質或遞送載體)，用來(尤其是)將某種目的核苷酸(NOI)或多種目的核苷酸轉移到一個或多個目的位點。人們對慢病毒載體系統的開發也表現出極大的興趣，因為慢病毒能夠感染非分裂細胞(Lewis&Emerman(1993)J.Virol.68：510)。另外，慢病毒載體使得目的基因能夠得到非常穩定的長期表達。對于體內轉導的大鼠神經元細胞來說，這已證實為至少一年(Bienemann等人.(2003)Mol.Ther.5：588)。

載體純化過程是臨床基因轉移治療中的一個重要步驟，就純度和滴度而言與安全性和功效直接相關。在大多數小規模的實驗應用中，可采用離心技術通過相對簡單的方法來濃縮和純化載體。但是，將純化方法進行放大以便為臨床使用進行大規模生產，這是一個重大挑戰。具體地講，當考慮生產人用載體時，必須采取諸如過濾除菌的額外步驟來確保載體制品的純度和安全性。

載體制備方法一般包括從穩定或短暫產生載體的細胞獲取載體和使用例如色譜法純化病毒載體。在工業過程中，最后一個步驟是滅菌步驟，并且在滅菌步驟之前通常使用至少一個超濾步驟以濃縮病毒載體和/或交換保持病毒載體的緩沖液。

有幾個出版物描述了從細胞純化病毒，其中大多數討論了使用特異性色譜基質來從細胞裂解物純化病毒。例如，美國專利No.6,261,823和美國專利No.5,661,023公開了包括使用單獨的陰離子交換樹脂的方法，而美國專利5,837,520公開了陰離子交換接著是親和色譜的這樣一種相續組合。Yamada等人證實用陰離子交換HPLC純化慢病毒載體能使基因轉移得到改善(Yamada等人.(2003)Biotechniques34(5)：1074-8，1080)。

仍需要能產出純產品而又能保持高滴度的大規模反轉錄病毒載體純化方法。本發明解決了這個需求。

發明概述

我們證明了，出乎意料的是，當過濾除菌步驟不是生產過程中的最后步驟時，可實現生產反轉錄病毒和慢病毒載體制劑的改進方法。具體地講，我們發現了在濃縮步驟(例如通過超濾)之后進行過濾除菌步驟會導致病毒載體滴度相當大的損失。這是出乎預料的，因為反轉錄病毒顆粒的直徑在80-120nm的范圍內，因此它們應當容易通過除菌過濾器的孔道；對于含有載體的細胞培養物上清液來說這的確如此，這種上清液進行常規過濾沒有觀察到功能滴度的損失。因此不清楚為什么一旦載體制品經過了加工就不再可能做到對制品進行過濾除菌而又不損失回收率。

此外，我們出乎預料地發現，如果在過濾除菌步驟之后進行最后的濃縮步驟，可獲得載體顆粒收率的增加。這與確立的病毒生產方法是相反的，在這些生產方法中濃縮步驟傳統上是在過濾除菌步驟之前進行的。我們還發現了，在過濾除菌之前例如通過稀釋載體顆粒制品來維持合適的載體顆粒濃度，也能改進載體顆粒收率。出乎預料的是，在該方法中的一些階段中降低載體顆粒濃度可實際上最終導致產品收率提高。

應理解，可通過無菌稀釋由本發明方法生產的制劑來生產較低劑量的制劑。本發明的生產方法優選是用于生產適合作為治療劑給予人體的臨床級制劑的大規模方法。

本文所述的反轉錄病毒和慢病毒載體制劑優選適合作為治療劑給予人體。

本發明的第一方面提供包括過濾除菌步驟的反轉錄病毒或慢病毒載體制劑生產方法，其中該過濾除菌步驟不是該生產方法中的最后步驟。

優選地，反轉錄病毒載體是慢病毒載體。

優選地，過濾除菌步驟在濃縮步驟之前進行。

優選地，濃縮步驟是該方法中的最后步驟，而過濾除菌步驟是該方法中的倒數第二個步驟。

優選地，濃縮步驟用超濾、優選切向流過濾、更優選中空纖維超濾來進行。

優選地，過濾除菌步驟用最大孔徑大小為約0.22μm的除菌過濾器進行。在另一個優選的實施方案中，最大孔徑大小為0.2μm。