[發明專利]棲土曲霉蛋白酶在制備傷口清創、促進傷口愈合的藥物中的應用

無效

• 申請號: 201410243456.0
• 申請日: 2014-06-03
• 公開（公告）號: CN103977398A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 陳宏林;朱昌來
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: A61K38/48
• 分類號: A61K38/48;A61P17/02;C12N9/62;C12R1/66
• 代理公司: 南通市永通專利事務所 32100
• 代理人: 葛雷

技術領域

本發明涉及一種棲土曲霉蛋白酶在制備傷口清創、促進傷口愈合的藥物中的應用。

背景技術

壓瘡、糖尿病足、燒傷及慢性傷口內存在很多失活組織。失活組織是機會性感染的優良培養基，會阻礙傷口的愈合。因此有效的清創是必要的。目前臨床上最常用的清創方式仍是手術清創。除此之外，還有采用蛋白水解酶的酶清創。酶清創可以將壞死或失活的組織分解清除，同時又不損害鄰近正常組織，從而達到清創目的。己有描述將枯草菌蛋白酶、膠原酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶及鏈激酶作為清創劑。但這些清創酶各有優缺點，并且早期清創效果尚未能完全令人滿意。

己發現棲土曲霉能夠產生水解能力很強的棲土曲霉中性蛋白酶。但把棲土曲霉蛋白酶作為傷口清創酶并未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種清創能力強、副作用小，并且制備工藝簡單、產量高的棲土曲霉蛋白酶在制備傷口清創、促進傷口愈合的藥物中的應用。

本發明的技術解決方案是：

一種棲土曲霉蛋白酶在制備傷口清創、促進傷口愈合的藥物中的應用。

所述傷口為燒傷傷口、壓瘡傷口、慢性感染傷口或糖尿病足傷口。

所述棲土曲霉蛋白酶由下列步驟制得：

(1)培養基的制備

發酵培養基配比為：麩皮3％、米糠1％、玉米粉1％、KH₂PO₄0.4％，加水至100％，并于120℃下高溫滅菌30分鐘；

(2)粗酶液的制備液

將棲土曲霉3.942菌種按培養基8％的重量接種后，在250r/min振蕩器中30℃下培養72小時；終止培養后，將發酵培養物于離心機中3000r/min離心10分鐘，取上清液即為粗酶液；

(3)棲土曲霉蛋白酶的分離

粗酶液過濾，濾液調節pH至7.0，加入20％濃度的單寧酸，邊加邊攪拌；單寧酸用量為粗酶液重量的1％；待沉淀完全后離心，收集沉淀；沉淀用pH7.2、0.02M磷酸緩沖液溶解；使用聚乙二醇洗脫單寧酸，在攪拌下加入10％濃度的PEG，使PEG與單寧酸之比值達到3:1ml/g；離心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，靜置過夜，離心，收集沉淀；沉淀再浸泡于冷丙酮，靜置過夜，然后過濾，沉淀用乙醚再洗滌一次，干燥即得棲土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制劑；

(4)棲土曲霉蛋白酶的純化

上述丙酮粉粗酶用pH8.4、0.05M?Tris‐HCL緩沖液溶解，上DEAE‐Sephadex?A‐25柱，然后用平衡緩沖液洗滌；層析共分離出7個峰，酶活力存在于P2峰內；收集P2峰，對水于低溫下透析至無鹽止，再用PEG脫水濃縮后，冷凍干燥。

(5)蛋白酶活力的測定

采用福林酚法測定蛋白酶活力。酶活定義為在40℃，適當的PH條件下，1分鐘內水解酪蛋白產生1微克酪氨酸所需的酶量為1個蛋白酶活力單位。測得棲土曲霉蛋白酶冷干粉的酶活力為1.1×10⁵U/g。

本發明由棲土曲霉獲得的能夠對無活力組織進行傷口清創的蛋白酶，清創能力強、副作用小，并且制備工藝簡單、產量高。

下面結合實施例對本發明作進一步說明。

具體實施方式

棲土曲霉蛋白酶的制備

(1)培養基的制備

發酵培養基配比為：麩皮3％、米糠1％、玉米粉1％、KH₂PO₄0.4％，加水至100％并于120℃下高溫滅菌30分鐘。

(2)粗酶液的制備液

將棲土曲霉3.942菌種按培養基8％的重量接種后，在250r/min振蕩器中30℃下培養72小時。終止培養后，將發酵培養物于離心機中3000r/min離心10分鐘，取上清液即為粗酶液。

(3)棲土曲霉蛋白酶的分離

粗酶液過濾，濾液調節pH至7.0。加入20％質量濃度的單寧酸，邊加邊攪拌。單寧酸用量為粗酶液重量的1％。待沉淀完全后離心，收集沉淀。沉淀用pH7.2、0.02M磷酸緩沖液溶解。使用聚乙二醇(PEG)洗脫單寧酸。在攪拌下加入10％質量濃度的PEG，使PEG(ml)與單寧酸(g)之比值達到3:1。離心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，靜置過夜，離心，收集沉淀。沉淀再浸泡于冷丙酮，靜置過夜，然后過濾，沉淀用乙醚再洗滌一次，干燥即得棲土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制劑。

(4)棲土曲霉蛋白酶的純化