[發(fā)明專利]一種S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410243148.8
• 申請日: 2014-05-30
• 公開（公告）號: CN104031875A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹業(yè)師;王欣
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種工程菌的構(gòu)建及應(yīng)用，特別涉及一種來源與乳酸菌的S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌及將大豆素或豆粕轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚的應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

大豆異黃酮具有多種生物學(xué)功能，從1980年起，大量醫(yī)學(xué)研究表明，大豆異黃酮除與雌激素受體結(jié)合，從而有效地預(yù)防骨質(zhì)疏松、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌外，還能與雄激素受體結(jié)合減少前列腺癌的發(fā)生，并具有抗氧化、抗溶血和抗真菌活性等。在動(dòng)物生產(chǎn)上，國內(nèi)外大量研究表明大豆異黃酮可以促進(jìn)雄性動(dòng)物生長，增強(qiáng)機(jī)體免疫，改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)，提高生產(chǎn)性能等。但大豆異黃酮的生物學(xué)作用在一定程度上歸因于其代謝產(chǎn)物雌馬酚，人體能否將大豆黃素代謝為雌馬酚是決定大豆異黃酮能否更有效地發(fā)揮其降低腫瘤、心血管疾病、骨質(zhì)疏松以及更年期綜合癥等慢性疾病風(fēng)險(xiǎn)作用的關(guān)鍵因素。因此雌馬酚的作用受到普遍關(guān)注，成為目前生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。雌馬酚是大豆異黃酮重要的代謝產(chǎn)物，人群中約有30％～50％的人能將大豆異黃酮轉(zhuǎn)化成雌馬酚進(jìn)而排泄，但影響其轉(zhuǎn)化的因素目前尚不完全清楚，其中腸道菌群可能是最重要的因素。

異黃酮類化合物在天然大豆中主要以結(jié)合了糖基的糖苷大豆異黃酮方式存在，即糖苷大豆黃酮(daidzin)和糖苷染料木素(genistin)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，糖苷形式的大豆異黃酮不能直接經(jīng)小腸壁吸收，因此沒有生理活性。而去除糖基配體后形成的中間代謝產(chǎn)物大豆黃酮苷元(daidzein)和染料木素苷元(genistein)等也只表現(xiàn)出弱雌激素樣活性。只有由腸道細(xì)菌特異性降解后產(chǎn)生的代謝終產(chǎn)物--雌馬酚才具有較高的生物學(xué)活性。與大豆黃酮苷元相比，雌馬酚與雌激素受體結(jié)合的親和力、抗氧化活性、抗前列腺癌作用更強(qiáng)，而在血漿中的清除速度更慢。因此大豆異黃酮的生物活性更多的是由其代謝終產(chǎn)物雌馬酚來實(shí)現(xiàn)的。

目前生產(chǎn)雌馬酚的主要方法為化學(xué)合成，其存在的兩個(gè)問題就是：(1)腸道菌代謝產(chǎn)生的雌馬酚都是S-型的，具有生物活性；而以大豆黃素為原料化學(xué)合成的雌馬酚是R-雌馬酚和S-雌馬酚混合的外消旋化合物，R-雌馬酚是沒有活性的；(2)化學(xué)合成需要金屬催化劑、氫氣、高壓高溫等，對生產(chǎn)設(shè)備要求高，產(chǎn)量低，成本也比較高。所以能否采用生物法合成雌馬酚成為大家關(guān)注的熱點(diǎn)。對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前與本發(fā)明密切相關(guān)的專利有“不動(dòng)桿菌AUH-JLM455及其轉(zhuǎn)化制備S-雌馬酚的方法”(申請?zhí)枺?00810147314.9)，“雌馬酚產(chǎn)生菌及利用”(申請?zhí)枺?01080007863.1)，“含有產(chǎn)生雌馬酚的乳酸菌的組合物”(申請?zhí)枺?00480020952.4)，“含有維持了雌馬酚產(chǎn)生能力的雌馬酚產(chǎn)生微生物的發(fā)酵制品及其制備方法”(申請?zhí)枺?00980136848.4)，“一種奇異變形桿菌菌株及其轉(zhuǎn)化大豆苷元生產(chǎn)S-雌馬酚的方法”(申請?zhí)枺?01210146746.4)，“一種屎腸球菌及其產(chǎn)生雌馬酚的方法與應(yīng)用”(申請?zhí)枺?01110086803.X)，和“一株降解大豆苷原產(chǎn)生雌馬酚的雙酶梭菌及其菌劑和應(yīng)用”(申請?zhí)枺?01010513344.4)。以上這些專利均是使用從腸道中分離獲得的單一或少數(shù)幾種細(xì)菌混合厭氧發(fā)酵生產(chǎn)雌馬酚，但研究發(fā)現(xiàn)分離到的這些細(xì)菌大部分是細(xì)菌新種，而且不同的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件會(huì)影響其是否能產(chǎn)生雌馬酚，再加上厭氧培養(yǎng)等要求較高，所以采用原始分離菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)雌馬酚的方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還有可能因?yàn)榕囵B(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的原因而影響雌馬酚產(chǎn)量和發(fā)酵成本。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對目前生物學(xué)方法生產(chǎn)S-雌馬酚的局限性，構(gòu)建了一種操作簡單、穩(wěn)定有效、發(fā)酵條件簡單的S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌。并利用此工程菌對S-雌馬酚的生產(chǎn)能力進(jìn)行了驗(yàn)證與應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌，所述工程菌是將來源于乳酸菌(Lactococcus?sp.)20-92的L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR和L-THDR基因克隆至大腸桿菌BL21(D3)，轉(zhuǎn)化得到S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌；所述L-DDRC的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1所示、L-DZNR的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：2所示、L-DHDR的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：3所示，L-THDR的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：4所示。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述S-雌馬酚產(chǎn)生工程菌按如下方法構(gòu)建：