[發明專利]一種S-雌馬酚產生工程菌及應用

有效

• 申請號: 201410243148.8
• 申請日: 2014-05-30
• 公開（公告）號: CN104031875A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發明（設計）人: 尹業師;王欣
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種S-雌馬酚產生工程菌，其特征在于所述工程菌是將來源于乳酸菌(Lactococcus?sp.)20-92的L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR和L-THDR基因克隆至大腸桿菌BL21(D3)，轉化得到S-雌馬酚產生工程菌；所述L-DDRC的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1所示、L-DZNR的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：2所示、L-DHDR的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：3所示，L-THDR的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：4所示。

2.一種權利要求1所述S-雌馬酚產生工程菌在制備S-雌馬酚中的應用，其特征在于所述的應用為：以大豆素或豆粕為底物，將S-雌馬酚產生工程菌經擴大培養獲得的種子液以體積濃度5％的接種量接種至BHI培養基或LB培養基，在好氧或厭氧條件下，37℃培養24h，向培養液中加入終濃度25mg/L的IPTG，37℃繼續培養6～72h后，取培養液分離純化，獲得S-雌馬酚；所述BHI培養基終濃度組成為：蛋白胨10g/L、脫水小牛腦浸粉12.5g/L、脫水牛心浸粉5.0g/L、氯化鈉5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氫二鈉2.5g/L，溶劑為水，pH值為7.0；所述LB培養基終濃度組成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化鈉10g/L，溶劑為水，pH值為7.0。

3.如權利要求2所述S-雌馬酚產生工程菌在制備S-雌馬酚中的應用，其特征在于所述大豆素的初始濃度為50μg/ml。

4.如權利要求2所述S-雌馬酚產生工程菌在制備S-雌馬酚中的應用，其特征在于所述豆粕的初始濃度為15g/L。

5.如權利要求2所述S-雌馬酚產生工程菌在制備S-雌馬酚中的應用，其特征在于所述的應用按如下步驟進行：(1)種子培養：將S-雌馬酚產生工程菌接種至含有終濃度50μg/ml羧芐青霉素和終濃度50μg/ml鏈霉素的BHI培養基中，37℃靜置，厭氧培養24h后，獲得種子液；(2)發酵培養及轉化反應：將大豆素或豆粕加入BHI培養基或LB培養基，然后以體積濃度5％的接種量接種種子液，在好氧或厭氧條件下，37℃培養24h，向培養液中加入終濃度25mg/L的IPTG，37℃繼續培養6～72h后，取培養液分離純化，獲得S-雌馬酚；所述大豆素的初始濃度為50μg/ml，所述豆粕的初始濃度為15g/L。

6.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述培養液分離純化的方法為：取1ml的培養液，8000r/min離心3分鐘，獲得上清a；取900μl上清a至另一干凈的2ml?EP管中，然后向管中加入900μl乙酸乙酯，充分混勻后靜置5min，5000r/min離心5分鐘，獲得上清b和沉淀b；取900μl上清b至另一干凈的2ml?EP管中；取沉淀b加入等量的乙酸乙酯重復離心1次，獲得上清c；將上清b和上清c混合在一起，移到2ml離心管中，45℃真空冷凍濃縮成粉末；加入200μl無水甲醇到該EP管溶解濃縮粉末，并經0.22μm聚偏氟乙稀微孔濾膜過濾，濾液即為S-雌馬酚。