[發(fā)明專利]一株過(guò)表達(dá)fusA基因工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410241622.3
• 申請(qǐng)日: 2014-06-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104212756B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王小元;趙建勛;胡曉清;李顏顏;尹良鴻
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/77;C12P13/06;C12P13/08;C12R1/15
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32104
• 代理人: 時(shí)旭丹,劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明涉及一株過(guò)表達(dá)fusA基因工程菌的構(gòu)建方法及其提高氨基酸產(chǎn)量的應(yīng)用，屬于基因工程和微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

????氨基酸是構(gòu)建生物體的眾多活性大分子之一，是構(gòu)建細(xì)胞、修復(fù)組織的基本材料。氨基酸能夠?yàn)闄C(jī)體和大腦活動(dòng)提供能源。構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本氨基酸有21種，有8種氨基酸人體不能自身合成，需從食物中獲取，為人體的必需氨基酸；另外人體自身合成的精氨酸、組氨酸不能滿足機(jī)體的需要，也需要從食物中攝取。氨基酸的平衡和適量供應(yīng)是人體健康的基本前提，任何一種氨基酸的缺乏，都會(huì)影響免疫系統(tǒng)和其他正常功能的發(fā)揮。因此氨基酸在食品、醫(yī)藥保健、飼料方面有很廣泛的應(yīng)用。?

????目前氨基酸的生產(chǎn)方法主要有蛋白質(zhì)水解提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。蛋白質(zhì)水解提取法是在酸性條件下，將動(dòng)植物組織水解，得到各種氨基酸混合物，經(jīng)分離、純化、精制等工序獲得所需的氨基酸。但天然蛋白質(zhì)的氨基酸組分復(fù)雜，提取分離難度較大，故目前生產(chǎn)上較少采用該方法。化學(xué)合成法雖然純度較高，但是反應(yīng)需高溫高壓條件，能耗大，成本高，得率較低，并且在生產(chǎn)工藝中涉及到了有毒有害有機(jī)溶劑的使用，安全性差，要得到具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的氨基酸，必須進(jìn)行光學(xué)異構(gòu)體的拆分。但是這種拆分工藝復(fù)雜，收率又低，一般也不采用。微生物發(fā)酵法是利用微生物自身酶系的催化功能，生物合成并過(guò)量積累氨基酸，具有原料成本低，生產(chǎn)周期短，環(huán)境污染小和產(chǎn)物純度高等優(yōu)點(diǎn)，是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的生產(chǎn)方法。此外，谷氨酸棒桿菌被認(rèn)為是安全的食品級(jí)生產(chǎn)菌株，被廣泛用來(lái)生產(chǎn)谷氨酸，賴氨酸，纈氨酸，丙氨酸，異亮氨酸等，谷氨酸棒桿菌以其生產(chǎn)氨基酸安全性佳，且產(chǎn)生的氨基酸不被降解的特點(diǎn)，在生產(chǎn)食用和醫(yī)用氨基酸中具有巨大潛力。國(guó)外主要采用發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸，國(guó)內(nèi)的菌種在產(chǎn)量方面還低于世界先進(jìn)水平，因此通過(guò)基因工程技術(shù)選育高產(chǎn)優(yōu)良菌株，?進(jìn)一步提高氨基酸的產(chǎn)量，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。?

發(fā)明內(nèi)容

????本發(fā)明提供過(guò)表達(dá)fusA基因提高氨基酸產(chǎn)量的方法及其應(yīng)用，與出發(fā)菌株相比實(shí)例菌株的氨基酸產(chǎn)量得到了顯著提高。?

????fusA基因編碼延伸因子EF-G。延伸因子EF-G的基因序列如SEQ?ID?NO:?1所示。EF-G是一種GTP酶，蛋白質(zhì)合成時(shí)，EF-G幫助核糖體在mRNA上易位。作為一種機(jī)動(dòng)蛋白，驅(qū)使著tRNA和mRNA在核糖體上的定向移動(dòng)。EF-G與轉(zhuǎn)位前復(fù)合物的相互作用能夠加速轉(zhuǎn)位的進(jìn)行，使速度提高1000?倍，加速了核糖體的利用效率和蛋白合成速度，可以使編碼氨基酸合成的關(guān)鍵酶大量合成，從而提高氨基酸產(chǎn)量。?

????本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：?

一株過(guò)表達(dá)fusA基因工程菌，其分類命名為谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum?subspecies?lactofermentum）WY001/?pDXW-8-fusA，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO.2014233。

延伸因子EF-G基因工程菌WY001/?pDXW-8-fusA的構(gòu)建方法，利用PCR擴(kuò)增克隆延伸因子EF-G基因fusA，將基因片段連接到[x1]?pDXW-8，然后利用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒桿菌WY001中，通過(guò)抗生素抗性篩選獲得目的基因工程菌WY001/?pDXW-8-fusA。?

????所述表達(dá)載體為誘導(dǎo)型表達(dá)載體。所述表達(dá)載體中的啟動(dòng)子為tac^*；表達(dá)載體的出發(fā)載體為pDXW-8。?

????延伸因子EF-G基因工程菌WY001/?pDXW-8-fusA的構(gòu)建方法，步驟如下：?

（1）設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增fusA

上游引物：5’-CTAGCTAGCA?GAAGGAGTAA?ATCGGTGGCT?CAAGAAGTGC?TTAAG-3’，下劃線為NheI酶切位點(diǎn)；

下游引物：5’-AACCCTCGAG?TTAGGAAGCG?GTGCCGTTGC-3’，下劃線為XhoI酶切位點(diǎn)；