[發(fā)明專利]一株過表達fusA基因工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410241622.3
• 申請日: 2014-06-03
• 公開（公告）號: CN104212756B
• 公開（公告）日: 2017-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王小元;趙建勛;胡曉清;李顏顏;尹良鴻
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12P13/06;C12P13/08;C12R1/15
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務(wù)所(普通合伙)32104
• 代理人: 時旭丹,劉品超

1.一株過表達fusA基因工程菌，其分類命名為谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum?subspecies?lactofermentum）WY001/?pDXW-8-fusA，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO.2014233。

2.一株過表達fusA基因的基因工程菌WY001/?pDXW-8-fusA的構(gòu)建方法，其特征在于PCR擴增克隆延伸因子EF-G基因fusA，將基因片段連接到表達載體pDXW-8，然后電轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌WY001中，通過抗生素抗性篩選獲得目的基因工程菌WY001/?pDXW-8-fusA；步驟如下：

（1）設(shè)計引物擴增fusA

上游引物：5’-CTAGCTAGCA?GAAGGAGTAA?ATCGGTGGCT??CAAGAAGTGC?TTAAG-3’，下劃線為NheI酶切位點；

下游引物：5’-AACCCTCGAG?TTAGGAAGCG?GTGCCGTTGC-3’，下劃線為XhoI酶切位點；

（2）將PCR產(chǎn)物和表達載體pDXW-8分別用NheI/XhoI雙酶切，回收后，將fusA和pDXW-8以6∶1～3∶1的摩爾比例，用T4連接酶在16℃連接2h，構(gòu)建重組表達載體pDXW-8-fusA；

（3）然后將重組質(zhì)粒pDXW-8-fusA導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌WY001中，在含有卡那霉素50μg/mL的LBHIS固體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48h，篩選轉(zhuǎn)化子；

（4）提取篩選的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用PCR驗證轉(zhuǎn)化子，從而獲得過表達fusA基因的基因工程菌WY001/?pDXW-8-fusA。

3.用權(quán)利要求2所述方法構(gòu)建的基因工程菌WY001/?pDXW-8-fusA的應(yīng)用，其特征在于在搖瓶培養(yǎng)生產(chǎn)氨基酸。

4.用權(quán)利要求2所述方法構(gòu)建的基因工程菌WY001/?pDXW-8-fusA的應(yīng)用，其特征在于在發(fā)酵罐生產(chǎn)氨基酸。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于生產(chǎn)的氨基酸為L-異亮氨酸及賴氨酸。