[發明專利]一種重組菌落快速檢測試劑及其快速檢測方法

無效

• 申請號: 201410240472.4
• 申請日: 2014-05-30
• 公開（公告）號: CN103981274A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 呂新;陳麗華;李玥仁;劉蘭英;李巍
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院中心實驗室
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

????本發明涉及一種重組菌落快速檢測試劑及其快速檢測方法，專用于基因克隆時陽性重組菌落的快速篩選，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

基因克隆是現代分子生物學中一種重要的技術手段，其主要步驟包括：1.目的基因的獲得、2.目的基因和載體的連接、3.重組DNA質粒的轉化和檢測。在基因克隆中，目的基因和載體在體外連接形成重組DNA質粒后，將重組DNA質粒和感受態大腸桿菌細胞相混合，使重組DNA質粒進入大腸桿菌中，就可以實現重組DNA質粒的轉化，并在含有抗生素的LB瓊脂平板培養基上形成重組菌落。

目前對于重組菌落的檢測主要采用：1.遺傳表型檢測法、2.限制性酶切法、3.PCR法。遺傳表型檢測法主要采用α互補檢測，其原理是載體上含有LacZ的調控序列和N端146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點。當這種載體進入可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞后（質粒和宿主細胞編碼的片段各自都沒有酶活性），它們可以融為一體，形成具有酶學活性的蛋白質，這種現象叫α互補。由α互補而產生的?Lac?細菌在呈色底物?5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）和誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）存在下形成藍色菌落。當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，導致產生無α互補能力的氨基端片段。因此，帶有重組DNA質粒的細菌形成白色菌落，通過呈色反應即可初步識別可能帶有重組DNA質粒的菌落。

限制性酶切法需要先對待檢測菌落進行小量液體搖菌，提取質粒DNA，用相應的限制性內切酶（一種或兩種）切割質粒DNA釋放出的插入片斷，對于可能存在雙向插入的重組子還可用適當的限制性內切酶消化檢測插入方向，然后用凝膠電泳檢測插入片斷和載體的大小來判斷是否為重組菌落。

PCR法檢測重組菌落主要采用菌落PCR法，其原理是采用目的基因的特異引物或載體上的通用引物，在常溫下隨機挑選轉化平板上的待檢測菌落，用滅菌的牙簽或槍頭挑取部分單個菌落，然后將沾有菌落的牙簽或槍頭置于預裝有上述引物PCR擴增混合液的PCR管中（菌落與PCR管要相對應做好記號，如平板上點的是#1，則管子上也標#1，以便篩選到克隆后的擴到培養），在PCR儀上直接以菌落熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增，最后用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物片段的大小來判斷是否為重組菌落。

目前檢測重組菌落時，通常使用上述的3種方法。但這3種方法在實際操作中均存在不盡人意的地方。α互補檢測中必須加入的呈色底物?5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）和誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）價格昂貴，大量篩選時勢必增加實驗成本。限制性酶切法，需對數十個菌落進行培養后提取質粒進行酶切檢測時，非常費力，另外，更為麻煩的是用限制性酶切法常遇到找不到適合用2種或2種以上限制性內切酶的緩沖液的情況，這時必須要分步進行酶切反應。菌落PCR法，反應易受環境污染造成假陽性，反應條件不合適又易造成假陰性，其次，如果沒有可以利用的引物，則還需為此合成。

鑒于上述問題，我們研究了一種操作簡便、方法快速、結果可靠的重組菌落快速檢測試劑，能在1小時內完成待檢測菌落的快速檢測和判斷，且檢測過程中不需要X-gal?和IPTG等昂貴試劑，結果準確性高，檢測時間比常規限制性酶切法大幅減少。此技術可應用于基因克隆中重組菌落快速檢測，特別在大量篩選重組菌落時將大幅減少篩選的時間和實驗成本。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中重組菌落檢測所需周期長、檢測結果準確性差，檢測成本高的問題，提供一種重組菌落快速檢測試劑以及操作快速、方法簡便、結果可靠的快速檢測方法。

本發明提供的重組菌落快速檢測試劑，其試劑包括：

（1）試劑A：?50-300?mM三羥基甲基氨基甲烷（Tris），5-50?mM?乙二胺四乙酸（EDTA），0.1-1?mg/mL?RNA酶A（RNase?A），0.05-0.15%?溴酚藍（Bromophenol?Blue）；

（2）試劑B：50-300?mM?NaOH，0.2-1%?SDS，10-30%蔗糖。

上述試劑的優選配方為：

試劑A：?50?mM三羥基甲基氨基甲烷（Tris），10?mM?乙二胺四乙酸（EDTA），0.1?mg/mL?RNA酶A（RNase?A），0.1%?溴酚藍（Bromophenol?Blue）；

試劑B：200?mM?NaOH，0.5%?SDS，20%蔗糖。