[發明專利]用于檢測馬傳染性貧血病毒p26蛋白的試劑盒及其用途

有效

• 申請號: 201410239152.7
• 申請日: 2014-05-30
• 公開（公告）號: CN104020294A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 王曉鈞;胡哲;林躍智;周建華
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

技術領域

本發明涉及一種病毒抗原檢測試劑盒及其用途，特別涉及一種用于檢測馬傳染性貧血病毒p26蛋白的試劑盒及其用途，本發明屬于病毒感染的診斷及檢測技術領域。

背景技術

馬傳染性貧血病毒(EIAV)是反錄病毒科(Retroviridae)慢病毒屬的成員，可引起馬、騾、驢的傳染性貧血病，以發熱、貧血、出血、黃疸、浮腫、心機能紊亂、血相變化和進行性消瘦為特征。根據臨診表現，常分為急性、亞急性、慢性和隱性4種病型,除有主要癥狀如發燒、貧血、黃疸、出血、心機能紊亂外，血液學的變化也很突出，如紅細胞數減少、血紅蛋白量降低、白細胞數常減少和靜脈血中出現吞鐵細胞等。該病呈世界分布，給養馬業造成巨大經濟損失。此外也曾有幾例人感染此病毒的報道。發燒期的病馬是最危險的傳染源，其血液和臟器(肝、脾、骨髓、淋巴結等)含有大量病毒，常隨同分泌物和排泄物排出體外而散播。慢性病馬能長期甚至終身帶毒。

EIAV是正鏈RNA病毒，其基因組結構與其它慢病毒相似。病毒RNA編碼三個主要結構基因gag、pol和env，此外還有幾個小開放閱讀框架(ORF?S1、S2、S3)，其中gag和pol基因部分重疊。病毒RNA基因組兩端是完全相同的重復區(R區)，在5’R下游是5’獨特區(US)；3’端R區上游是3’獨特區(U3)。EIAvGag前體蛋白為分子量為55KD的Pr55，Pr55經病毒編碼的蛋白酶裂解產生四種主要的結構蛋白。分別為基質蛋白MP15、衣殼蛋白CA/p26、核衣殼蛋白NC/P11及核心蛋白p9。基質蛋白MA、衣殼蛋白CA、核衣殼蛋白NC是構成病毒粒子的主要蛋白，尤其是p26，可以占病毒蛋白總量的40％，在病毒裝配和出芽過程中發揮重要作用。由于P26蛋白非常保守，任何不同血清型的馬傳貧病毒感染馬都能產生對P26抗原的抗體，因此P26蛋白是馬傳貧免疫瓊脂擴散(AGID)和ELISA診斷法使用的主要抗原。

馬傳貧的流行病毒調查主要以血清學檢測為主，然而血清抗體的產生往往滯后于病毒感染，因此，血清學檢測抗體會有漏檢的情況出現。目前，針對EIAV抗原檢測的方法主要有RT-PCR方法、ELISA方法以及傳統的病毒分離鑒定等，病毒分離耗時費力，熒光定量RT-PCR使用Taq探針法價格昂貴，相比之下，ELISA方法最為簡便快捷、成本低又敏感性高、特異性好。然而利用ELISA方法檢測EIAV病毒的報道并不多見，國際上也沒有檢測馬傳貧病毒的商品化試劑盒。目前多采用商品化的反轉錄酶試劑盒檢測和定量EIAV病毒，但是該試劑盒中應用HIV的反轉錄酶作為標準品，因此在定量和檢測EIAV時的準確性并不十分理想，而且該試劑盒價格昂貴，不適合于大批量臨床樣品的檢測。因此，建立一種快速、敏感、可靠的方法檢測EIAV病毒，形成可應用于實際臨床樣本檢測的ELISA商品化試劑盒是十分必要和亟待解決的。

該檢測方法的應用對及時控制疾病傳播和蔓延，最大限度的減少馬傳貧對養馬業造成的損失具有重要的意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種用于檢測馬傳染性貧血病毒p26蛋白的試劑盒及其用途。

為此，本發明發明人制備并篩選出了兩株能夠識別馬傳染性貧血病毒p26蛋白不同抗原表位的雜交瘤細胞株，特異性實驗證明由該兩株雜交瘤細胞株分泌產生的單克隆抗體只與馬傳染性貧血病毒而不與I型馬皰疹病毒，IV型馬皰疹病毒，馬流感病毒以及馬動脈炎病毒反應，說明本發明的方法特異性好。此外，靈敏度實驗證明使用本發明的方法檢測馬傳染性貧血病毒p26蛋白抗原，其敏感性為98pg。因此，本發明為馬傳染性貧血病毒的檢測提供了一種有效的，準確性高的新的檢測手段。

具體的，本發明的上述目的是通過以下技術方案實現的：

本發明的一種用于檢測馬傳染性貧血病毒p26蛋白的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含由保藏號CGMCC?NO.9106以及保藏號為CGMCC?NO.9107的雜交瘤細胞株分泌產生的單克隆抗體，任選其中一種單克隆抗體是用辣根過氧化物酶或異硫氰酸熒光素或生物素標記的。

其中，保藏號為CGMCC?NO.9106的雜交瘤細胞株，命名為EIAV-p26-1G11，分類命名為單克隆抗體雜交瘤細胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，保藏日期為2014年4月21日。