[發明專利]慶大霉素半抗原及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410238929.8
• 申請日: 2014-05-30
• 公開（公告）號: CN105017347B
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 馮才偉;羅曉琴;馮靜;王建霞;何方洋;吳小勝;齊向武;孫倩倩
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: C07H15/236
• 分類號: C07H15/236;C07H1/00;C07K14/765;C07K14/435;C07K14/77;C07K14/78;C07K14/795;C07K16/44;G01N33/577
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技術領域

本發明涉及一種慶大霉素半抗原及其制備方法和應用。

背景技術

慶大霉素(Gentamicin，GM)屬于氨基糖甙類抗生素，主要作用于革蘭氏陰性細菌，由于其具有廣譜抑菌和殺菌作用，被廣泛應用于獸醫臨床和動物飼料添加劑。但GM的血清有效濃度與毒性濃度很相近，安全范圍較小，在其應用過程中易產生毒副作用，尤其大劑量不規范使用，易導致動物性食品中GM殘留超標，對人體健康構成危害，造成腎毒性和耳毒性。許多國家在動物生產中嚴禁使用GM或規定有嚴格的最高殘留限量(MRL)，我國農業部235號公告規定，動物性食品中GM的MRL為100ng/g。

目前慶大霉素殘留檢測方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法、高效毛細管電泳法和免疫學檢測法。儀器法檢測價格昂貴，不適合在基層推廣使用和大量篩選。免疫學測定方法靈敏度較高，特異性強，使用方便。因此，大規模篩選檢測以免疫學檢測方法更實際、更具有應用前景。酶聯免疫吸附法(ELISA)以其靈敏度高、特異性好、操作簡便、成本低等優點適合于大量樣品的快速篩選。

發明內容

本發明的目的是提供一種慶大霉素半抗原及其制備方法和應用。

本發明提供的慶大霉素半抗原分子結構式如式Ⅰ所示：

本發明提供的慶大霉素半抗原的制備方法，包括如下步驟：

在100mL兩口燒瓶中加入0.5g對溴甲基苯甲酸及1.05g慶大霉素和10mL乙醇，攪拌至溶解，加熱至45℃反應6小時后，減壓蒸除溶劑。乙醇-水體系中重結晶得到對羧芐基慶大霉素，得到半抗原產物。

本發明的另一個目的是上述慶大霉素半抗原在免疫檢測中的應用，具體包括由所述慶大霉素半抗原與載體蛋白偶聯得到的慶大霉素抗原，及由所得慶大霉素抗原免疫動物制備得到的慶大霉素抗體，所述抗體為慶大霉素單克隆抗體。

其中所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、甲狀腺蛋白、卵清蛋白、人血清蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。

本發明還提供由上述慶大霉素半抗原或慶大霉素抗原在檢測慶大霉素或制備檢測慶大霉素的產品中的應用，具體涉及制備的酶聯免疫檢測試劑盒在檢測動物源性食品中慶大霉素殘留的應用。

本發明提供的慶大霉素半抗原、慶大霉素抗原合成方法簡單，通過免疫動物產生了針對慶大霉素的特異性抗體，抗體的效價、特異性都比較好；用所得的抗體制備酶聯免疫檢測試劑盒，檢測成本低，使用方便，檢測方法準確、快速、可同時檢測大批量的樣本，適于動物源性食品中慶大霉素殘留的現場監控和大量樣本的篩查。本發明的慶大霉素半抗原在慶大霉素的檢測中發揮重要作用。

附圖說明

圖1：慶大霉素半抗原合成路線圖

圖2：慶大霉素半抗原核磁共振圖

圖3：慶大霉素ELISA標準曲線

具體實施方式

下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而不用來限制本發明的范圍。

下述實施例中所使用的實驗方法、材料、試劑等，如無特殊說明，均為常規方法和常規材料。

實施例1：慶大霉素半抗原的合成和鑒定(合成路線如圖1)

在100mL兩口燒瓶中加入0.5g對溴甲基苯甲酸及1.05g慶大霉素和10mL乙醇，攪拌至溶解，加熱至45℃反應6小時后，減壓蒸除溶劑。乙醇-水體系中重結晶得到對羧芐基慶大霉素，得到半抗原產物。

上述慶大霉素半抗原分子結構式如式Ⅰ所示：

取上述產物用核磁共振確定結構，如圖2所示，11.0ppm的羧基信號峰、7.44ppm及8.09ppm的芳環信號峰，說明半抗原合成成功。

實施例2：慶大霉素抗原的制備

將慶大霉素半抗原與載體蛋白偶聯得到慶大霉素抗原，分子結構式如式Ⅱ所示：

一、免疫原制備

取14mg慶大霉素半抗原用1mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，各取30mg碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)用0.2mL水充分溶解后加入上述溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應液A；稱取牛血清白蛋白(BSA)50mg，使之充分溶解在3.8mL PBS(pH7.2)溶液中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h；用0.01mol/L PBS溶液在4℃透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質；分裝，于-20℃保存備用。

二、包被原制備