[發明專利]固相萃取和氣相色譜聯用測定結構脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的方法

有效

• 申請號: 201410235634.5
• 申請日: 2014-05-30
• 公開（公告）號: CN104049057A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 董緒燕;劉四磊;吳琳;陳洪;魏芳;呂昕;鐘娟
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: G01N30/90
• 分類號: G01N30/90;G01N30/88
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 黃行軍

技術領域

本發明涉及一種檢測結構脂的方法，具體涉及一種固相萃取和氣相色譜聯用測定結構脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的方法。

背景技術

脂質是人類膳食的主要組成部分，在人體三大能量營養素中占有重要的地位。隨著人們生活水平的不斷提高，人類對膳食中脂質的營養提出了新的要求。吃好油、吃營養健康油，已成為我國消費者關注自身健康、保證正常營養攝取的新需求。

研究表明，油脂中TAGs的含量高達95％以上。TAGs中脂肪酸的組成、碳鏈長短、雙鍵數目及位置是影響油脂物理化學性質及營養價值的重要因素，尤其是甘油骨架上脂肪酸的位置分布對甘油酯在人體內的吸收代謝及其營養價值具有重要影響。甘油酯中脂肪酸的位置可以分為兩大類，即α(Sn-1,3)位和β(Sn-2)位。在人體的胃腸道內，胰脂肪酶是消化脂質的最主要酶，具有較高的α位專一性。?；讦廖簧希舅嵋杂坞x的形式被吸收，而酰基在β位時，則是以單甘酯的形式被吸收，且β位單甘酯更易被人體吸收利用。甘油酯的這種“脂肪酸?；恢眯睂τ谥笇Чδ苡椭a品的研發有著非常重要的意義。

結構脂質(StructuredLipid，SLs)，通過改變三酰甘油骨架上脂肪酸組成及位置分布，將具有特殊營養或生理功能的脂肪酸結合到特定位置，從而充分發揮各種脂肪酸的物理和營養功能性質。結構脂作為一類新型功能性油脂，其開發與應用程度越來越廣。在合成SLs的過程中，常伴隨著TAG、DAG、MAG、FFA的產生。產物中TAG、DAG、MAG、FFA的分離是優化反應條件、鑒定反應產物的前提。此外，建立一種高通量的快速有效測定SLs中α、β位置脂肪酸組成的方法，在SLs研究工作中有著重要的現實意義。

一直以來，分離TAG、DAG、MAG、FFA的方法主要是TLC法和正相高效液相色譜法(NP-HPLC)。TLC法的制板、平衡、分離、提取等操作比較復雜，被測樣品經過點樣后暴露在空氣中，增加了脂肪酸的氧化幾率，尤其是對于一些長碳鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFAs)影響較大。另外，由于TLC法難于定量，且存在用時長、受操作者操作水平的影響較大等缺點，因此，只能作為定性分析的一種輔助手段，從而限制了它的進一步應用。而NP-HPLC儀器昂貴，且需要先記錄相應標準品的保留時間，在進行樣品分析時，需要按照各個組分的保留時間分別收集各個組分，經GC進行脂肪酸檢測，因此存在有機溶劑消耗大、費時等缺點。相對于傳統的TLC法和HPLC法，固相萃取技術具有有機溶劑消耗少、富集倍數高，能有效對SLs合成產物中TAG、DAG、MAG、FFA快速有效分離等特點，結合GC法，能實現測定結構脂α、β位置脂肪酸及甘油酯的組成分析。本發明對固相萃取小柱分離TAG、DAG、MAG及FFA的洗脫條件進行優化，建立了采用商品化的固相萃取小柱完成了SLs合成過程中產生的TAG、DAG、MAG、FFA的快速有效分離，結合GC法，實現了SLs中α、β位置脂肪酸及甘油酯的組成分析，該方法操作簡便，快速有效，便于批量處理樣品。

發明內容

本發明的目的在于提供一種固相萃取和氣相色譜聯用測定結構脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的方法，該方法具有操作簡便、樣品需求量低、需要溶劑消耗量少、定性定量分析結果準確、檢測限低、分析時間快的優點。

為了實現上述目的，本發明的技術方案是：一種固相萃取和氣相色譜聯用測定結構脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的方法，先利用純的花生四烯酸-甘油三酯(ARA-TAG)、二十二碳六烯酸-甘油二酯(DHA-DAG)、亞麻酸-甘油一酯(Ln-MAG)、油酸-游離脂肪酸(O-FFA)標準品，通過優化不同極性配比的洗脫液洗脫條件，在同一根SPE小柱上實現混合物中TAG、DAG、MAG、FFA的有效分離，其特征在于它包括如下步驟：

1)混合標準樣品的分離和脂肪酸組成分析

(1)樣品制備：分別稱取花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亞麻酸-甘油一酯、油酸-游離脂肪酸標準品，按花生四烯酸-甘油三酯：二十二碳六烯酸-甘油二酯：亞麻酸-甘油一酯：油酸-游離脂肪酸的質量比為5-50mg:5-50mg:5-50mg:5-50mg，混合，用正己烷溶解，質量濃度控制在5mg/mL～50mg/mL之間，得到樣品，并置于-20℃冰箱保存；

(2)柱子活化：將固相萃取小柱置于固相萃取裝置上，用5-10倍固相萃取小柱內的填料體積的正己烷對柱子進行平衡活化(為常規方法；正己烷為填料體積的5-10倍)；固相萃取小柱內填料為弗羅里硅土；