[發(fā)明專利]固相萃取和氣相色譜聯(lián)用測定結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410235634.5 | 申請日： | 2014-05-30 |
| 公開（公告）號： | CN104049057A | 公開（公告）日： | 2014-09-17 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 董緒燕;劉四磊;吳琳;陳洪;魏芳;呂昕;鐘娟 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所 |
| 主分類號： | G01N30/90 | 分類號： | G01N30/90;G01N30/88 |
| 代理公司： | 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104 | 代理人： | 黃行軍 |
| 地址： | 430062 湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 萃取 和氣 色譜 聯(lián)用 測定 結(jié)構(gòu) 位置 脂肪酸 甘油酯 組成 方法 | ||
1.一種固相萃取和氣相色譜聯(lián)用測定結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的方法，其特征在于它包括如下步驟：
1)混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的分離和脂肪酸組成分析
(1)樣品制備：分別稱取花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亞麻酸-甘油一酯、油酸-游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，按花生四烯酸-甘油三酯：二十二碳六烯酸-甘油二酯：亞麻酸-甘油一酯：油酸-游離脂肪酸的質(zhì)量比為5-50mg:5-50mg:5-50mg:5-50mg，混合，用正己烷溶解，質(zhì)量濃度控制在5mg/mL～50mg/mL之間，得到樣品，并置于-20℃冰箱保存；
(2)柱子活化：將固相萃取小柱置于固相萃取裝置上，用5-10倍固相萃取小柱內(nèi)的填料體積的正己烷對柱子進(jìn)行平衡活化；固相萃取小柱內(nèi)填料為弗羅里硅土；
(3)上樣：將步驟(1)中配制的樣品轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱中，樣品上樣體積為固相萃取小柱內(nèi)的填料體積的1-2倍，控制流速<5mL/min；
(4)洗脫：用不同極性配比的洗脫液正己烷：無水乙醚＝85：15、70：30、25：75(v/v)，無水乙醚：冰醋酸＝95：5(v/v)分別淋洗柱子，分別收集洗脫液，氮吹儀下吹干洗脫液，得洗脫物；
(5)TLC檢測：向步驟(4)收集的洗脫物中加入正己烷，質(zhì)量濃度控制在5mg/mL～50mg/mL之間，渦旋混勻，得洗脫樣品；取洗脫樣品點(diǎn)樣于硅膠板，置于層析缸中進(jìn)行薄層層析，所用展層劑為正己烷：無水乙醚：冰醋酸＝50：50：1(v/v/v)，自然晾干后，置于碘蒸汽中顯色至斑點(diǎn)完全顯現(xiàn)，觀察花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亞麻酸-甘油一酯、油酸-游離脂肪酸是否實(shí)現(xiàn)分離，并確定各洗脫物的類型；
(6)GC檢測：將步驟(4)收集的洗脫物進(jìn)行甲酯化衍生化處理，根據(jù)步驟(5)的結(jié)果判斷洗脫物的種類，對于脂肪酸的甲酯化反應(yīng)采用濃H2SO4/甲醇加熱法進(jìn)行，對于甘油酯的甲酯化反應(yīng)采用KOH/甲醇法進(jìn)行；取步驟(5)洗脫樣品50μL，溶于2mL石油醚，振蕩1-2s，加入1mL5％(v/v)的濃H2SO4/甲醇溶液或者1mL0.4mol/LKOH/甲醇溶液，渦旋5min，然后加入2mL0.9％(w/v)的氯化鈉水溶液，輕微振蕩5-10秒，5000rpm離心5min，最后取上清液進(jìn)行GC分析；得GC色譜圖，數(shù)據(jù)分析，計(jì)算各脂肪酸的百分含量；
(7)根據(jù)步驟(6)中脂肪酸組成，結(jié)合步驟(5)中各洗脫物的類型，得到甘油三脂、甘油二酯、甘油一酯和游離脂肪酸的脂肪酸組成；
2)結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的分析
(1)對于結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸組成的分析，稱取300mg結(jié)構(gòu)脂于30mL玻璃試管中，加20mg豬胰脂酶，2mLTris-HCl緩沖液，搖勻后，加0.5mL膽酸鈉溶液，0.2mLCaCl2溶液，渦旋混勻后，于40℃水浴鍋中震蕩反應(yīng)5min后，加入1mL無水乙醚，1mLHCl溶液，震蕩均勻后，5000r/min離心2min，取上層，氮吹吹干得樣品；
(2)將步驟(1)中的樣品按步驟1)中(2)-(6)進(jìn)行，根據(jù)豬胰脂酶對α位置脂肪酸水解的專一性，得到甘油一酯和游離脂肪酸的組成，確定結(jié)構(gòu)脂α、β位置的脂肪酸組成；
(3)對于結(jié)構(gòu)脂甘油酯組成的分析，其樣品按步驟1)中(2)-(7)進(jìn)行，確定甘油酯的組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固相萃取和氣相色譜聯(lián)用測定結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的方法，其特征在于：取上清液進(jìn)行GC分析，GC分析儀器為：Agilent7890A型氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測器；色譜柱：HP-FFAP(30m×0.25mm×0.5μm)；進(jìn)樣量1μL；分流比30：1；程序升溫：初溫210℃，保持8min，20℃/min升溫至240℃，并保持7min。
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