[發明專利]利用全基因組和EST數據開發多態性EST?SSR標記的方法

有效

• 申請號: 201410235537.6
• 申請日: 2014-05-24
• 公開（公告）號: CN104673884B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: 楊先泉;劉堅;瞿靜濤;王西瑤;劉春雷;倪蘇;李立芹;易游人;袁娟
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G06F19/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及利用全基因組和EST數據開發多態性EST-SSR標記的方法，屬于分子生物學領域。

背景技術

SSR標記的原理是與微衛星序列相鄰的兩側區域保守性通常較高，可以在此保守區域設計一對特異的PCR引物，擴增其中的微衛星序列，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示出個體間在此位點的微衛星序列的多態性。由于SSR在基因組中大量地、隨機地分布，具有廣泛的位點變異，揭示比RAPD、RFLP更多的多態性，并且SSR標記為共顯性標記，能夠區分純合型和雜合型，提供完整的遺傳信息，在檢測多態性時可以采用PCR方法，不需要過多的分子克隆手段，對DNA模板的要求不高，重復性好。因此成為日前運用最廣泛的分子標記之一，廣泛地運用于動植物、微生物鑒定、遺傳多樣性分析、分子標記連鎖圖的構建和群體遺傳學等遺傳與育種研究領域。

傳統的SSR標記是通過構建小片段或大片段的基因組，篩選陽性克隆。通過傳統的影印或挑單菌落點膜的方法，把克隆轉移到尼龍膜上，經過固定后，用標記過的序列重復寡核苷酸或含微衛星序列的探針與尼龍膜上的克隆點雜交，篩選出其中的陽性克隆，然后測序、設計引物、優化PCR反應條件，獲得的陽性克隆經過確認后，全部或經過隨機挑選后測序，然后根據微衛星序列兩側保守區域的序列設計引物，獲得穩定、可靠的SSR標記，耗時耗力，而且成本非常高。

隨著測序技術的不斷發展，基因組序列數據資源不斷增加，人們開始利用生物信息學方法基于基因組序列數據篩選SSR位點，采用遺傳差異足夠大的多個基因組序列或生物樣本對候選SSR標記進行多態性篩選和鑒定。基因組序列或生物樣本間遺傳差異小會導致具有潛在利用價值的多態性SSR標記被誤淘汰；僅采用基因組序列數據開發的多態性分子標記通常位于基因間序列，通常只適合于遺傳多樣性及其相關研究，在與基因(遺傳功能)有關的研究(如功能基因克隆)中應用價值有限。

現在開發SSR標記的序列的另一種來源是EST，由于基因功能組學的快速發展，EST被大量測序，并存放在公共序列數據庫中，利用EST序列，篩選開發SSR標記的方法簡單易行，已發展成為開發SSR標記的主要方法。但是建庫時，數據庫中的EST是由不同的研究者用隨機或鳥槍法獲得的，這就會造成EST的冗余性。在進行EST-SSR標記開發時，SSR位點搜索前要先對EST數據進行比對、拼接，去除冗余序列否則極有可能對同一個SSR位點設計不同的引物，并且費時費力存在錯誤拼接的可能，而且去除的冗余序列中可能含有SSR長度的多態性。綜合現在所有的SSR標記方法，新開發的標記通常都需要采用兩個以上不同基因組序列對候選SSR標記進行多態性篩選和鑒定，否則就需要運用基因型差異足夠大的多個樣本DNA進行實驗室篩選和驗證，其間供試基因組序列、樣本間無差異的SSR標記必然會被淘汰。而對于基因組序列數據來源較少、差異小和供試基因型樣本的差異不大、代表性不足、具有潛在利用價值的多態性SSR標記極有可能被誤淘汰。因此，現有技術還有待于改進和發展。

發明內容

有鑒于此，本發明目的在于：提供利用全基因組和EST數據開發多態性EST-SSR標記的方法，該方法可以大大提高全基因組數據來源較少、實驗室驗證時供試樣本間差異較小，但EST數據較豐富的物種EST-SSR標記的開發效率，并防止因供試驗證基因組序列或實驗材料遺傳差異不足而淘汰具有潛在利用價值的SSR標記。所開發的多態性EST-SSR標記與單一基因緊密關聯，具有更高的遺傳與育種應有價值。

為實現上述目的，本發明采用如下之技術方案：

利用全基因組和EST數據開發多態性EST-SSR標記的方法，包括下述步驟：

一種利用全基因組和EST數據開發多態性EST-SSR標記的方法，其特征在于，包括下述步驟：

①獲取基因組序列與EST數據，從公共數據庫下載基因組序列數據、相應的基因注釋信息和EST數據，用基因組注釋信息進行基因組外顯子、內含子序列分析，選取基因TSS轉錄起始位點前2000bp作為啟動子序列；

②將步驟①獲得的全基因組數據進行SSR位點搜索與分析，采用MISA程序掃描全基因組染色體DNA序列，搜索、分析基因組序列中包含的SSR位點。采用MISA程序的默認SSR掃描參數：單核苷酸重復、二核苷酸重復、三核苷酸重復、四核苷酸重復、五核苷酸重復以及六核苷酸重復，重復單元分別大于10、7、6、5、4、4次重復；距離100bp的視為一個SSR位點；每種重復基元的各種變異類型及其反向互補類型均歸為一類；