[發明專利]一種利用BiFC指示細胞中Wnt信號活性狀態的載體組合物及應用有效

申請號：	201410234150.9	申請日：	2014-05-29
公開（公告）號：	CN104004098A	公開（公告）日：	2014-08-27
發明（設計）人：	吳畏;丁雅潔;湯瑋欣	申請（專利權）人：	清華大學
主分類號：	C07K19/00	分類號：	C07K19/00;G01N33/68;C12N15/62;C12N15/63;C12N5/10
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種利用 bifc 指示細胞 wnt 信號活性狀態載體組合應用
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種利用BiFC指示細胞中Wnt信號活性狀態的載體組合物及應用。

背景技術

經典的Wnt信號通路是一條保守而重要的信號轉導通路，與胚胎發育、成體組織穩態、癌癥發生都有著密切聯系。在多種癌癥中，例如結直腸癌、乳腺癌、肺癌、皮膚癌等等，都已經檢測到因為通路成員突變等多種原因造成的Wnt信號的異常激活。因此，對Wnt信號通路的研究以及以Wnt信號為靶點的藥物篩選都具有非常重要的意義。

關于經典Wnt信號的工作模式，目前人們認為，當Wnt信號被激活時，降解復合體的功能被抑制，使得β-catenin得以在細胞質中積累，進而入核與轉錄因子TCF結合一同激活下游靶基因的轉錄。近年來，已經有許多基因被鑒定為Wnt信號通路靶基因，這些基因在細胞增殖、細胞存活、細胞代謝等多個領域都發揮著重要作用。因此，β-catenin與TCF家族成員(TCF1、LEF1、TCF3、TCF4)發生相互作用形成復合體被認為是Wnt信號過程中的關鍵步驟，成為Wnt信號轉錄調控的重要開關。該關鍵步驟也被認為是藥物篩選的重要靶點之一。

為了顯示Wnt信號在細胞內的活性狀態，人們發明了多種方法。TOPFLASH報告系統便是一種廣泛應用的方法，該系統可通過報告基因熒光素酶的表達顯示Wnt靶基因的轉錄輸出狀態。

在雙分子熒光互補技術(BiFC)系統中，熒光蛋白被截成N段、C段兩部分，分別與兩個目標蛋白構建為融合蛋白。單獨的熒光蛋白片段本身不能發出熒光，并且在細胞空間范圍內隨機接近的幾率很小。只有當兩個目標蛋白之間發生相互作用時，才可以拉近熒光蛋白片段，有利于它們重組成完整的熒光蛋白進而發出熒光，如圖1所示。BiFC可用于觀測活細胞內蛋白分子間的相互作用，也可以通過其熒光定位顯示互作發生的位置。BiFC在多種物種的細胞組織中均能使用，例如在哺乳動物細胞、植物組織、線蟲等多種系統中都具有可行性。BiFC信號可在普通顯微鏡下進行檢測，不需要特殊分析手段。BiFC系統可以在較低的蛋白水平下檢測到熒光，并且只需要兩個熒光蛋白片段之間具有一定的結構上的柔性。總體來說，BiFC為顯示活細胞內蛋白之間的相互作用提供了直接、便捷、高精度的技術手段。

目前，還沒有報道利用BiFC技術顯示β-catenin水平及下游水平的蛋白互作情況。

發明內容

本發明的一個目的地是提供一種用于檢測細胞內Wnt信號活性狀態的融合蛋白組。

本發明提供的融合蛋白組，由融合蛋白A和融合蛋白B組成：

所述融合蛋白A包括β-catenin的C端缺失片段和位于其C段的熒光蛋白片段A；

所述融合蛋白B包括轉錄因子TCF和位于其N段的熒光蛋白片段B；

所述β-catenin的C端缺失片段為β-catenin蛋白氨基酸序列N末端起第2-667個氨基酸殘基。

上述的融合蛋白組中，

所述融合蛋白A從N端起依次由所述β-catenin的C端缺失片段、連接肽和熒光蛋白片段A組成；

所述融合蛋白B從N端起依次由所述轉錄因子TCF、連接肽和熒光蛋白片段B組成；

所述熒光蛋白片段A和所述熒光蛋白片段B來源于同一個熒光蛋白或不同熒光蛋白。

上述的融合蛋白組中，