[發明專利]一種利用BiFC指示細胞中Wnt信號活性狀態的載體組合物及應用

有效

• 申請號: 201410234150.9
• 申請日: 2014-05-29
• 公開（公告）號: CN104004098A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 吳畏;丁雅潔;湯瑋欣
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;G01N33/68;C12N15/62;C12N15/63;C12N5/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.一種用于檢測細胞內Wnt信號活性狀態的融合蛋白組，由融合蛋白A和融合蛋白B組成：

所述融合蛋白A包括β-catenin的C端缺失片段和位于其C段的熒光蛋白片段A；

所述融合蛋白B包括轉錄因子TCF和位于其N段的熒光蛋白片段B；

所述β-catenin的C端缺失片段為β-catenin蛋白氨基酸序列N末端起第2-667個氨基酸殘基。

2.根據權利要求1所述的融合蛋白組，其特征在于：

所述融合蛋白A從N端起依次由所述β-catenin的C端缺失片段、連接肽和熒光蛋白片段A組成；

所述融合蛋白B從N端起依次由所述轉錄因子TCF、連接肽和熒光蛋白片段B組成；

所述熒光蛋白片段A和所述熒光蛋白片段B來源于同一個熒光蛋白或不同熒光蛋白。

3.根據權利要求2所述的融合蛋白組，其特征在于：

所述TCF為TCF1、TCF2、TCF3、TCF4或其轉錄變體。

所述連接肽的氨基酸序列為序列表中序列2；

所述熒光蛋白為EYFP和/或Venus熒光蛋白；

所述熒光蛋白片段A為Venus蛋白氨基酸殘基自N末端第155-238位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸殘基自N末端第159-238位氨基酸；

所述熒光蛋白片段B為Venus蛋白氨基酸殘基自N末端第1-173位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸殘基自N末端第1-158位氨基酸。

4.根據權利要求3所述的融合蛋白組，其特征在于：

所述融合蛋白A從N端起依次由所述β-catenin的C端缺失片段、連接肽和熒光蛋白片段A組成；所述熒光蛋白片段A為Venus蛋白氨基酸殘基自N末端第155-238位氨基酸；

所述融合蛋白B從N端起依次由所述轉錄因子TCF3、連接肽和熒光蛋白片段B組成；所述熒光蛋白片段B為EYFP蛋白氨基酸殘基自N末端第1-158位氨基酸；

所述融合蛋白A的氨基酸序列具體為序列表中的序列8；

所述融合蛋白B的氨基酸序列具體為序列表中的序列14。

5.DNA分子組，其由編碼融合蛋白A的DNA分子A和編碼融合蛋白B的DNA分子B組成，所述DNA分子A的核苷酸序列為序列表中序列7；所述DNA分子B的核苷酸序列為序列表中序列13。

6.重組載體組，由表達融合蛋白A的重組載體和表達融合蛋白B的重組載體組成；

所述表達融合蛋白A的重組載體為將所述編碼融合蛋白A的DNA分子插入表達載體得到的載體。

所述表達融合蛋白B的重組載體為將所述編碼融合蛋白B的DNA分子插入表達載體得到的載體。

7.一種轉基因細胞系，為將所述表達融合蛋白A的重組載體和所述表達融合蛋白B的重組載體共同導入宿主細胞中得到的細胞系。

8.權利要求1-4中所述融合蛋白組、權利要求5所述的DNA分子組、權利要求6所述的重組載體組或權利要求7所述的轉基因細胞系在利用BiFC檢測影響細胞Wnt信號的物質中的應用；

或權利要求1-4中所述融合蛋白組、權利要求5所述的DNA分子組、權利要求6所述的重組載體組或權利要求7所述的轉基因細胞系在利用BiFC檢測細胞中Wnt活性狀態中的應用。

9.一種利用BiFC檢測或鑒定影響細胞內Wnt信號的物質的方法，包括如下步驟：

將小分子物質作用權利要求7所述的轉基因細胞系，檢測處理后的轉基因細胞系，

若處理轉基因細胞系的BiFC熒光信號比處理前轉基因細胞系強，則所述小分子物質為激活細胞內Wnt信號的物質；

若處理轉基因細胞系的BiFC熒光信號比處理前轉基因細胞系弱，則所述小分子物質為抑制細胞內Wnt信號的物質；

所述小分子物質具體為導致TCF缺失的干擾RNA、GSK3β、E-cadherin、LiCl、BIO、NC043或SRSF1蛋白。

10.一種用于檢測細胞內Wnt信號活性狀態的方法，將所述表達融合蛋白A的重組載體和所述表達融合蛋白B的重組載體共同導入宿主細胞，得到轉基因細胞，觀察轉基因細胞，若有熒光產生，表明激活細胞中的Wnt信號，若無熒光產生，表明未激活細胞中的Wnt信號，實現可視化觀察細胞中的Wnt信號活性狀態或變化。