[發明專利]甲酸切割位點肽及其相關生物材料與它們在生產降鈣素中的應用

有效

• 申請號: 201410231041.1
• 申請日: 2014-05-28
• 公開（公告）號: CN105218633B
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 劉昱輝;張華光;李梅
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K19/00;C12N15/11;C12N15/62;C07K1/12;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/20;C07K14/585
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

本發明公開了甲酸切割位點肽及其相關生物材料與它們在生產降鈣素中的應用。本發明所提供的甲酸切割位點肽，名稱為CA3，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的肽。利用本發明的甲酸切割位點肽CA3作為甲酸切割位點構建的融合蛋白，在如下甲酸切割條件下的切割率為85.3％：甲酸(切割劑)濃度為40％(體積百分比)，切割溫度為43℃，切割時間為2.5h。含有本發明的甲酸切割位點肽CA3的融合蛋白進行甲酸切割生產目的蛋白，甲酸切割時間短且切割效率高，有效提高融合蛋白的切割效率，節約了目的蛋白的純化成本，為蛋白重組的工業生產開啟新的思路，為蛋白產品的生產提供技術支撐。

技術領域

本發明涉及生物技術領域中甲酸切割位點肽及其相關生物材料與它們在生產降鈣素中的應用。

背景技術

重組表達具有表達速度快、成本低、生產效率高等優點使其成為多肽合成的便捷方法。蛋白重組表達的關鍵技術是目的蛋白的純化，重組表達一般采用融合蛋白的表達方法，因此，目的蛋白從融合蛋白上切割分離下來是重組表達的關鍵，對于蛋白產品而言融合蛋白的切割和分離效率顯得格外重要。目前融合蛋白的切割反應主要有化學切割和酶切割兩種。

酶解的方法相對來說反應條件較溫和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特異性。位點特異性蛋白酶(例如凝血酶、腸激酶、Xa因子等)通常被用來切割融合蛋白。凝血酶在這三種酶中是特異性活性最高的，能夠有效切割質量比僅為1:2000的蛋白，但酶切效率非常低，在用于切割時只有10％的酶能發揮切割功能。腸激酶的專一性是上述三種中最好的，但由于切割效率低(通常要求質量比達到1:10)而顯得比較昂貴。Xa因子似乎對于切點周圍的序列很敏感，經常會出現特異性位點切割不理想卻發生別的位點被切割的情況。更重要的是蛋白酶本身能混入目的蛋白中，造成新的污染，提高純化的復雜性。

相對于酶學切割，化學切割在融合蛋白的切割中效率更高，成本低廉、操作簡便，并且在融合蛋白切割中沒有新的蛋白引入，樣品純化更加簡單，因此成為研究的熱點。目前，廣泛應用的化學切割方法主要有以下幾種：

溴化氫(CNBr)切割法，CNBr通過切割Met殘基羧基端分離融合蛋白。優點是成本低且有效；缺點CNBr在有Met存在下即可切割蛋白，裂解位點的特異性低，可能對目的蛋白產生不必要修飾。

羥胺(NH₂OH)切割法，NH₂OH可專一性切割多肽中的肽鍵Asn-Gly。優點是不會帶來異源污染，成本相對較低。缺點是羥胺不穩定、易分解，且毒性較大。

基于Ca²⁺的肽鍵Asp-Pro切割法，優點是切割時間快，30分鐘內就可以完成切割；缺點是對切割體系要求嚴格，切割溶液中除所需離子外其它離子存在時切割效率明顯降低，成本高，操作步驟繁瑣。

肽鍵D-P(Asp-Pro)的甲酸切割法。在酸性條件下，D-P鍵被切開是親核攻擊的結果(Maria Thuveson,Erik Fries,2000)。Benjamin D.等(Benjamin D,1989)已在實驗中證明在酸性條件下發生斷裂的僅為D-P鍵，原理是低pH時Pro的側鏈環會發生質子化，而激發Asp殘基上的β碳基團會對其α碳基團發起親核攻擊，從而使D-P鍵斷開。Asp-Pro甲酸切割法的優點有以下三個：(1)只在酸性條件下才能完成切割，且低pH可以限制性地切割D-P鍵，不會對其他肽鍵產生影響；(2)在絕大多數蛋白中D-P出現的概率非常低；(3)對溶液環境要求較低，溶液中其他離子的存在不影響切割效率，可通過適當提高溫度來增加切割效率。主要的缺點與不足之處包括兩點：(1)切割時間相對較長，一般完成全部切割需為30小時左右；(2)低pH可能影響蛋白的活性和穩定性。