[發(fā)明專利]一種同時(shí)檢測(cè)水生動(dòng)物敗血癥三種致病菌的多重PCR引物組及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410229181.5
• 申請(qǐng)日: 2014-05-27
• 公開（公告）號(hào): CN104004842A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張德鋒;劉禮輝;吳淑勤;李寧求;石存斌;付小哲;林強(qiáng);任燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

1.一種同時(shí)檢測(cè)水生動(dòng)物敗血癥三種致病菌的多重PCR引物組，其核苷酸序列分別如下所示：

嗜水氣單胞菌引物組的核酸序列如下：

AH-F1：5’-CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA-3’（SEQ?ID?NO?:1），或者為該序列的核酸互補(bǔ)序列；

AH-R1：5’-GCGGGTACGACGCACCTTGC-3’（SEQ?ID?NO?:2），或者為該序列的核酸互補(bǔ)序列；

維氏氣單胞菌引物組的核酸序列如下：

AV-F2：5’-?AGCCAAGCAGGATCTGGTGAAG-3’（SEQ?ID?NO?:3），或者為該序列的核酸互補(bǔ)序列；

AV-R2：5’-?CTTGTTGAACTCGGGGCTCGCT-3’（SEQ?ID?NO?:4），或者為該序列的核酸互補(bǔ)序列；

鮰愛德華氏菌引物組的核酸序列如下：

EI-F3：5’-CCAATTACGTGAGGATACGGCG-3’（SEQ?ID?NO?:5），或者為該序列的核酸互補(bǔ)序列；

EI-R3：5’-CCCCGGCGGTTATACAGACG-3’（SEQ?ID?NO?:6），或者為該序列的核酸互補(bǔ)序列。

2.一種同時(shí)檢測(cè)水生動(dòng)物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于：包括以下步驟：

1）DNA模板的制備；

2）多重PCR擴(kuò)增體系如下：

2×mix????????????????????23~27μL

10μmol/L?AH-F1????????????1~3μL

10μmol/L?AH-R1????????????1~3μL

10μmol/L?AV-F2?????????????1~3μL

10μmol/L?AV-R2?????????????1~3μL

10μmol/L?EI-F3?????????????1~3μL

10μmol/L?EI-R3?????????????1~3μL

DNA模板??????????????????1~2μL

ddH₂O?????????????????????加至50μL；?

3）多重PCR擴(kuò)增條件為：94~96℃預(yù)變性3~6min，94~95℃變性45~55?s，55~60℃退火25~35s，72℃延伸50~60s，進(jìn)行28~35個(gè)循環(huán)后，然后再72℃溫度延伸7~10?min，完成PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存；

4）PCR產(chǎn)物檢測(cè)：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、凝膠成像觀察，若有1091?bp的條帶說(shuō)明樣品中有嗜水氣單胞菌，若有262?bp?的條帶說(shuō)明樣品中維氏氣單胞菌，若有450?bp的條帶說(shuō)明樣品中有鮰愛德華氏菌，若這種大小的條帶都不存在，說(shuō)明樣品中嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和鮰愛德華氏菌這三種菌為陰性。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種同時(shí)檢測(cè)水生動(dòng)物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于：步驟1）所述的DNA模板制備的具體操作為：將待測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物的組織勻漿液750~850?g離心4~6min，取上清，9000~11000g離心8~12min，收集沉淀，加入0.1M的TE緩沖液，95~100℃處理8~12min；9000~11000g離心8~12min，收集上清液即待測(cè)DNA模板。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種同時(shí)檢測(cè)水生動(dòng)物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于：步驟2）所述的多重PCR擴(kuò)增體系為：

2×mix????????????????????25μL

10μmol/L?AH-F1????????????1μL

10μmol/L?AH-R1????????????1μL

10μmol/L?AV-F2?????????????3μL

10μmol/L?AV-R2?????????????3μL

10μmol/L?EI-F3?????????????2μL

10μmol/L?EI-R3?????????????2μL

DNA模板??????????????????1μL

ddH₂O?????????????????????加至50μL。