[發(fā)明專利]一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR引物組及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410229181.5
• 申請日: 2014-05-27
• 公開（公告）號: CN104004842A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張德鋒;劉禮輝;吳淑勤;李寧求;石存斌;付小哲;林強;任燕
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多重PCR檢測方法，具體涉及一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR引物組及檢測方法。

背景技術(shù)

細菌性敗血癥又叫淡水魚類暴發(fā)性流行病，最早于1986年發(fā)現(xiàn)，1989年起開始在全國大范圍流行，很多水產(chǎn)養(yǎng)殖動物都可感染，如鯽、鳊、鯉、鰱、鳙、草魚，斑點叉尾鮰等。該病的發(fā)病率和死亡率均很高，是我國養(yǎng)魚史上危害魚的種類最多、流行地區(qū)最廣、流行季節(jié)最長、造成的損失最嚴(yán)重的一種急性傳染病。嗜水氣單胞菌(Aeromonas?hydrophila，AH)是引起水生動物細菌性敗血癥的主要致病菌，近年來維氏氣單胞菌(Aeromonas?veronii，AV)是也引起多種水生動物發(fā)生多器官敗血癥的常見致病菌，在斑點叉尾鮰中引起敗血癥的癥狀的主要病原菌為鮰愛德華氏菌（Edwardsiella?ictaluri，EI）。

基于現(xiàn)有技術(shù)檢測水產(chǎn)動物致病菌大多沿用傳統(tǒng)的病樣細菌分離培養(yǎng)及鑒定等方法，而該方法檢測步驟繁瑣，周期較長，靈敏度低。在應(yīng)對突發(fā)的疾病發(fā)生事件時，不能滿足診斷及時、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度和特異性高以及大量樣品檢測的要求。鑒于此，為了能夠?qū)崿F(xiàn)快速對水生動物中多種致病菌的診斷和監(jiān)控，各國學(xué)者研究出了一些新的觀點和方法，如酶聯(lián)免疫分析法（EILISA）、熒光免疫分析法（FIA）和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。針對嗜水氣單胞菌、鮰愛德華氏菌等單一致病菌的PCR檢驗方法已經(jīng)建立起來法，在水產(chǎn)動物敗血癥基本上都是沿用普通PCR方法，通常一次只能檢測一種致病菌，檢測時間長且常常造成漏檢或誤檢。然而，水生動物養(yǎng)殖過程中，需要對魚類突發(fā)敗血癥病的致病菌進行快速檢測和分子流行病學(xué)調(diào)查，其樣本量大、時間緊，采用單一致病菌的PCR檢測技術(shù)和一般方法不能滿足要求，因此，建立簡便、快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測方法同時適用于這三種主要病原菌的檢測方法尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述存在的問題，本發(fā)明提供了一種可以同時檢測水生動物敗血癥致病菌的多重PCR檢測方法。

本發(fā)明的目的在于提供一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR引物組。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR引物組，其核苷酸序列分別如下所示：

嗜水氣單胞菌引物組的核酸序列如下：

AH-F1：5’-CAGCGTCCAATACCTGGTGTTA-3’（SEQ?ID?NO?:1），或者為該序列的核酸互補序列；

AH-R1：5’-GCGGGTACGACGCACCTTGC-3’（SEQ?ID?NO?:2），或者為該序列的核酸互補序列；

維氏氣單胞菌引物組的核酸序列如下：

AV-F2：5’-?AGCCAAGCAGGATCTGGTGAAG-3’（SEQ?ID?NO?:3），或者為該序列的核酸互補序列；

AV-R2：5’-?CTTGTTGAACTCGGGGCTCGCT-3’（SEQ?ID?NO?:4），或者為該序列的核酸互補序列；

鮰愛德華氏菌引物組的核酸序列如下：

EI-F3：5’-CCAATTACGTGAGGATACGGCG-3’（SEQ?ID?NO?:5），或者為該序列的核酸互補序列；

EI-R3：5’-CCCCGGCGGTTATACAGACG-3’（SEQ?ID?NO?:6），或者為該序列的核酸互補序列。

一種同時檢測水生動物敗血癥三種致病菌的多重PCR檢測方法，包括以下步驟：

1）DNA模板的制備；

2）多重PCR擴增體系如下：

2×mix????????????????????23~27μL

10μmol/L?AH-F1????????????1~3μL

10μmol/L?AH-R1????????????1~3μL

10μmol/L?AV-F2?????????????1~3μL

10μmol/L?AV-R2?????????????1~3μL

10μmol/L?EI-F3?????????????1~3μL

10μmol/L?EI-R3?????????????1~3μL

DNA模板??????????????????1~2μL