[發明專利]豬偽狂犬病毒gE IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201410227400.6
• 申請日: 2014-05-27
• 公開（公告）號: CN103983781A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 牟林琳;劉潔;孫慶歌;李建;漆世華;朱薇;溫文生;謝紅玲;馮釗
• 申請（專利權）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

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技術領域

本發明涉及一種檢測試紙卡及其制備方法，具體涉及一種豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡及其制備方法和應用。

背景技術

豬偽狂犬病，是由豬偽狂犬病毒（Pseudorabies?Virus，PRV）引起的以懷孕母豬繁殖障礙、新生仔豬高熱和神經僵直癥狀為特征的一種烈性傳染病，可達100%的高死亡率。由于豬是該病最主要的貯存宿主，病豬和帶毒豬均為本病的傳染源，且流行范圍遍及世界，嚴重危害著世界養豬業發展。

本病的檢測方法較多，主要有ELISA和PCR等，但這些方法存在操作復雜、需要專門儀器和人員、檢測時間長等缺點，膠體金免疫層析方法是在免疫滲濾的基礎上發展起來的快速檢測方法，該方法操作簡單、重復性好、靈敏度高，結果快速直觀、并可大量制備，工藝簡單、成本低廉，適合基層大批量現場檢測。而且，目前這些方法多檢測PRV抗原和IgG抗體，很少檢測IgM抗體。而gE蛋白是PRV重要的糖蛋白，但其不是病毒增殖必須的蛋白，很多疫苗將便將其作為基因缺失疫苗的缺失段。因此gE?IgM抗體的膠體金免疫層析法檢測能快速有效區分野毒早期感染，為該病的早期診斷和預防以及豬場的凈化提供了一種快速簡便的方法。

發明內容

本發明的首要目的在于彌補現有檢測技術的缺點與不足，提供一種豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡。該檢測試紙卡將樣品吸收區純化的豬偽狂犬病毒gE蛋白作為檢測抗原，特異性結合待檢血清中豬偽狂犬病毒gE蛋白的IgM抗體，再結合膠體金標記抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體，固化抗體區檢測線處包被的鼠抗豬IgM單克隆抗體進行捕獲，利用夾心法進行豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體的檢測。

本發明的另一目的在于提供上述豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的制備方法。

本發明的再一目的在于提供上述豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡在豬群PRV早期感染診斷中的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡，包括樣品吸收區、金標探針區、固化抗體區、吸水區、底板和卡殼，樣品吸收區、金標探針區、固化抗體區和吸水區依次粘貼于底板并相互重疊裝入卡殼內；所述的樣品吸收區包被有純化的豬偽狂犬病毒gE蛋白，其包被量優選為1～50μg；所述的金標探針區包被有金標探針，所述的金標探針為膠體金標記的抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體，其標記量優選為每毫升膠體金標記1～30μg單抗，包被量優選為10～50μL/cm；固化抗體區依次有檢測線T和對照線C，檢測線T包被有鼠抗豬IgM單克隆抗體，包被量優選為0.1～10μg/cm，對照線C包被有羊抗鼠IgG，包被量優選為0.1～10μg/cm。

所述的樣品吸收區的材料為聚酯纖維膜；所述的金標探針區的材料為玻璃纖維膜；所述的固化抗體區的材料為硝酸纖維素膜；所述的吸水區的材料為吸水濾紙；所述的底板的材料為聚乙烯板；所述的卡殼為帶可視窗和樣品孔的塑料卡殼。

上述豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的制備方法，包括如下步驟：將純化的豬偽狂犬病毒gE蛋白包被于聚酯纖維膜上；將膠體金標記的抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體噴涂于玻璃纖維膜上；將鼠抗豬IgM單克隆抗體包被于硝酸纖維素膜檢測線T處，將羊抗小鼠IgG包被于硝酸纖維素膜對照線C處。將聚酯纖維膜、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝到聚乙烯板上，裝入卡殼內，得到豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡。

優選的，所述的豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的制備方法，包括如下步驟：

（1）純化的豬偽狂犬病毒gE蛋白的制備：

1）提取豬偽狂犬病毒基因組，參照GenBank發表的登陸號為AF403050.1?PRV廣東株基因序列，針對gE基因設計引物：

上游引物：5^，-ATGGATTCATGCTGAGGGAGGCACCCCCG-3^，，

下游引物：5^，-CGAAGCTTTAATAACGGCCGGTCGCCCAC-3^，；

2）用步驟1）所述的基因設計引物擴增基因片段后克隆到pGEM-T-Vector上，再將克隆后的基因片段插入PET-32a原核表達載體，構建pET-32a-gE重組表達載體；