[發明專利]豬偽狂犬病毒gE IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201410227400.6
• 申請日: 2014-05-27
• 公開（公告）號: CN103983781A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 牟林琳;劉潔;孫慶歌;李建;漆世華;朱薇;溫文生;謝紅玲;馮釗
• 申請（專利權）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

1.一種豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡，其特征在于：包括樣品吸收區、金標探針區、固化抗體區、吸水區、底板和卡殼；樣品吸收區、金標探針區、固化抗體區和吸水區依次粘貼于底板并相互重疊裝入卡殼內；所述的樣品吸收區包被有純化的豬偽狂犬病毒gE蛋白；所述的金標探針區包被有金標探針，所述的金標探針為膠體金標記的抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體；所述的固化抗體區依次有檢測線T和對照線C，所述的檢測線T包被有鼠抗豬IgM單克隆抗體，所述的對照線C包被有羊抗鼠IgG。

2.根據權利要求1所述的豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡，其特征在于：所述的純化的豬偽狂犬病毒gE蛋白的包被量為1～50μg；所述的金標探針的標記量為1～30μg/mL，包被量為10～50μL/cm；所述的鼠抗豬IgM單克隆抗體的包被量為0.5～10μg/cm；所述的羊抗鼠IgG的包被量為0.1～10μg/cm。

3.根據權利要求1所述的豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡，其特征在于：所述的樣品吸收區的材料為聚酯纖維膜；所述的金標探針區的材料為玻璃纖維膜；所述的固化抗體區的材料為硝酸纖維素膜；所述的吸水區的材料為吸水濾紙；所述的底板的材料為聚乙烯板；所述的卡殼為帶可視窗和樣品孔的塑料卡殼。

4.權利要求1-3任一項所述的豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的制備方法，其特征在于包括如下步驟：將純化的豬偽狂犬病毒gE蛋白包被于聚酯纖維膜上；將膠體金標記的抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體噴涂于玻璃纖維膜上；在硝酸纖維素膜檢測線T處包被鼠抗豬IgM單克隆抗體、對照線C處包被羊抗鼠IgG；將包被有純化的豬偽狂犬病毒gE蛋白的聚酯纖維膜、包被有膠體金標記的抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體的玻璃纖維膜、包被有檢測線T和對照線C的硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次組裝到聚乙烯板上，裝入卡殼內，得到豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡。

5.根據權利要求4所述的豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）純化的豬偽狂犬病毒gE蛋白的制備：

1）提取豬偽狂犬病毒基因組，參照PRV廣東株基因序列，針對gE基因設計引物：

上游引物：5^，-ATGGATTCATGCTGAGGGAGGCACCCCCG-3^，，

下游引物：5^，-CGAAGCTTTAATAACGGCCGGTCGCCCAC-3^，；

2）用步驟1）所述的基因設計引物擴增基因片段后克隆到pGEM-T-Vector上，再將克隆后的基因片段插入PET-32a原核表達載體，構建pET-32a-gE重組表達載體；

3）將構建的pET-32a-gE重組表達載體轉化至大腸桿菌BL21中，進行誘導表達；

4）將步驟3）制得的表達產物經親和層析法純化后獲得純化的重組蛋白gE；

（2）抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體的制備：包括如下步驟：

1）將前述豬偽狂犬病毒gE蛋白常規免疫Balb/c小鼠，當小鼠血清ELISA效價達到1:10000取脾細胞與骨髓瘤細胞融合；用ELISA法和間接免疫熒光方法篩選陽性雜交瘤細胞；采用有限稀釋法亞克隆后得到單抗雜交瘤細胞株；

2）選8周齡雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降植烷，7天后腹腔注射抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株，接種量為2×10⁶細胞/0.5mL/只，一周后待小鼠腹部膨大抽取腹水，經硫酸銨沉淀純化即得純化的抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體；

（3）膠體金標記抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體的方法：分別取半徑為20～40nm的濃度為0.01%的膠體金20mL調pH值為8.2～9.0，加入抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體20～600μg，在攪拌條件下使其結合，加BSA作為穩定劑，且使得BSA終濃度為0.1～10%，離心除去未結合的抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體和未穩定的膠體金顆粒以及凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀用2mL?0.01M?pH值為7.4的?PBS溶解，即為膠體金標記抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體的復合物；

（4）聚酯纖維膜的制備：將上述純化的豬偽狂犬病毒gE蛋白用0.01M?pH值為7.4的?PBS溶解后均勻包被于聚酯纖維膜上，包被量為1～50μg，烘干；

（5）玻璃纖維膜的制備：將上述膠體金標記抗豬偽狂犬病毒gE蛋白單克隆抗體的復合物噴涂于玻璃纖維膜上，包被量為10～50μL/cm，凍干；

（6）硝酸纖維素膜的制備：檢測線T包被鼠抗豬IgM單克隆抗體，包被量為0.1～10μg/cm，對照線C包被羊抗鼠IgG，包被量為0.1～10μg/cm；

（7）試紙卡制備：將聚酯纖維膜、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次相互重疊組裝到聚乙烯板上，用切條機切成4mm寬試紙，裝入卡殼內，即得到豬偽狂犬病毒gE?IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡。