[發(fā)明專利]一種富含咖啡酰熊果苷的樟葉越桔的組織培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410226087.4
• 申請日: 2014-05-27
• 公開（公告）號: CN103999773A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設計）人: 趙平;唐軍榮;羅旭璐;闞歡;劉云;李旭
• 申請（專利權）人: 昆明凌覽生物科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種富含咖啡酰熊果苷的樟葉越桔的組織培養(yǎng)方法。

背景技術

樟葉越桔(Vaccinium?dunalianum)是杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)植物，常綠灌木。主產(chǎn)于云南、四川、貴州、西藏等地，我國臺灣以及錫金、不丹、印度(東北部)、緬甸(東北部)至越南亦有分布，在云南省境內(nèi)則主要分布于云南西北部經(jīng)滇中高原至滇南和滇東南。其幼嫩葉芽，因形似雀嘴呈錐狀，在云南彝族民間又稱“雀嘴茶”，據(jù)記載自明代開始就作為一種茶代用品長期飲用至今，具有祛風除濕、舒筋活絡等功效。越桔屬植物富含多種營養(yǎng)成分，并具有多方面的生理活性，同時也是廣泛應用于化妝品行業(yè)的熊果苷(arbutin)原料的主要植物來源之一。熊果苷是源于綠色植物的天然活性物質(zhì)，是當今流行的最為安全有效的美白原料，也是國際公認的二十一世紀的理想皮膚美白祛斑活性劑。由于熊果苷作為次生代謝產(chǎn)物通常以微量形式存在于植物體中，且天然植物來源困難，因此，篩選熊果苷高產(chǎn)天然植株或尋找熊果苷天然替代品已經(jīng)成為當務之急。

申請人前期研究發(fā)現(xiàn)，樟葉越桔是一種富含咖啡酰熊果苷類物質(zhì)的特殊資源植物，其中6’-O-咖啡酰熊果苷的得率高達植物材料干重的22％(Zhao?P,Tanaka?T,Hirabayashi?K,et?al,2008.Caffeoyl?arbutin?and?related?compounds?from?the?buds?of?Vaccinium?dunalianum.Phytochemistry,69(18):3087-3094.)，并對其制備方法進行了專利保護(趙平,張穎君,許敏,楊崇仁,2007.6’-O-咖啡酰基熊果甙的制備方法.授權專利號：ZL200710065956.X)。生物活性研究結果表明，該化合物的酪氨酸酶抑制活性和抗氧化等活性均優(yōu)于熊果苷，且毒性僅為熊果苷的1/2，可望作為熊果苷天然替代品加以應用，具有重要的開發(fā)價值。由于樟葉越桔處于野生狀態(tài)，生長緩慢，分布有限，加之隨著雀嘴茶的關注度不斷提高，導致其連年遭受破壞性采摘，野生樟葉越桔數(shù)量急劇減少。現(xiàn)有技術目前尚無采用組織培養(yǎng)技術獲得高含量咖啡酰熊果苷植物材料的報道，有必要采用現(xiàn)代生物技術手段解決當前樟葉越桔的資源匱乏問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術存在的不足，基于咖啡酰熊果苷在樟葉越桔植物體的分布特點及其所具有的藥理活性，提供一種培養(yǎng)過程簡單、高效且富含咖啡酰熊果苷的樟葉越桔的組織培養(yǎng)方法。該方法具有繁殖速度快、周期短、咖啡酰熊果苷含量高等優(yōu)點，是獲取大量高含量咖啡酰熊果苷的樟葉越桔材料的有效途徑。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術方案：

一種富含咖啡酰熊果苷的樟葉越桔的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

(1)從葉越桔植株上獲取當年生的樟葉越桔莖段作為外植體，外植體剪除葉片剪成4～6cm長的莖段，用洗潔精水浸泡30～60min，流水沖洗1～2h后再用酒精和升汞消毒，消毒后用無菌水沖洗，無菌條件下切成帶1～2個葉腋的莖段，然后葉腋朝上斜插于腋芽誘導培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，葉腋處誘導出腋芽后繼續(xù)培養(yǎng)；所述的腋芽誘導培養(yǎng)基為：WMP+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.5～1.5mg/L+活性炭2.0～3.0g/L，pH5.4～5.8。

(2)腋芽的增殖誘導：待腋芽長成3cm以上的小苗后，將其切成1.5～2cm長帶1～3個葉腋的莖段，然后葉腋朝上斜插于腋芽增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)至小苗長至3～4cm高且葉腋處可誘導出新的不定芽小苗即得到樟葉越桔組培苗；反復將3～4cm高的組培苗切成1.5～2cm長帶1～3個葉腋的莖段在腋芽增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，可以使得樟葉越桔進行快速大量的擴繁；所述的腋芽增殖培養(yǎng)基為：WMP+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.2～1.0mg/L+活性炭1.0～2.0g/L，pH5.4～5.8。

(3)樟葉越桔組培苗的生根誘導：將樟葉越桔組培苗接種于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導生根得到樟葉越桔生根苗；所述的生根培養(yǎng)基為：WMP+6-BA0.5～1.5mg/L+NAA0.1～1.0mg/L+活性炭0.1～1.0g/L，pH5.4～5.8。

步驟(1)中所述的消毒優(yōu)選為：用75％酒精浸泡15～30s，再用0.1％升汞浸泡7～12min。

步驟(1)中所述的培養(yǎng)條件優(yōu)選為：培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強度2000～2500lx，光照周期比14～15h:9～10h。