[發明專利]一種富含咖啡酰熊果苷的樟葉越桔的組織培養方法

有效

• 申請號: 201410226087.4
• 申請日: 2014-05-27
• 公開（公告）號: CN103999773A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 趙平;唐軍榮;羅旭璐;闞歡;劉云;李旭
• 申請（專利權）人: 昆明凌覽生物科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種富含咖啡酰熊果苷的樟葉越桔的組織培養方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)從葉越桔植株上獲取當年生的樟葉越桔莖段作為外植體，外植體剪除葉片剪成4～6cm長的莖段，用洗潔精水浸泡30～60min，流水沖洗1～2h后再用酒精和升汞消毒，消毒后用無菌水沖洗，無菌條件下切成帶1～2個葉腋的莖段，然后葉腋朝上斜插于腋芽誘導培養基上進行培養，葉腋處誘導出腋芽后繼續培養；所述的腋芽誘導培養基為：WMP+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.5～1.5mg/L+活性炭2.0～3.0g/L，pH5.4～5.8；

(2)腋芽的增殖誘導：待腋芽長成3cm以上的小苗后，將其切成1.5～2cm長帶1～3個葉腋的莖段，然后葉腋朝上斜插于腋芽增殖培養基中進行培養；培養至小苗長至3～4cm高且葉腋處可誘導出新的不定芽小苗即得到樟葉越桔組培苗；所述的腋芽增殖培養基為：WMP+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.2～1.0mg/L+活性炭1.0～2.0g/L，pH5.4～5.8；

(3)樟葉越桔組培苗的生根誘導：將樟葉越桔組培苗接種于生根培養基中培養誘導生根得到樟葉越桔生根苗；所述的生根培養基為：WMP+6-BA0.5～1.5mg/L+NAA0.1～1.0mg/L+活性炭0.1～1.0g/L，pH5.4～5.8。

2.根據權利要求1所述的樟葉越桔的組織培養方法，其特征在于：步驟(1)中所述的消毒為：用75％酒精浸泡15～30s，再用0.1％升汞浸泡7～12min。

3.根據權利要求1所述的樟葉越桔的組織培養方法，其特征在于：腋芽誘導培養基、腋芽增殖培養基和生根培養基中的凝膠劑是瓊脂或卡拉膠，培養基中的蔗糖為食用白糖，培養基中的水為自來水，培養基pH值用1mol/LNaOH或HCl來調節。

4.根據權利要求3所述的樟葉越桔的組織培養方法，其特征在于：凝膠劑的終濃度為4～5g/L，蔗糖的終濃度為20～30g/L。

5.根據權利要求1所述的樟葉越桔的組織培養方法，其特征在于：步驟(1)中所述的培養條件為：培養溫度25±2℃，光照強度2000～2500lx，光照周期比14～15h:9～10h。

6.根據權利要求1所述的樟葉越桔的組織培養方法，其特征在于：步驟(2)中所述的培養條件為：培養溫度27±2℃，光照強度2100～2300lx，光照周期比12h:12h。

7.根據權利要求1所述的樟葉越桔的組織培養方法，其特征在于：步驟(3)中所述的培養條件為：培養溫度28±2℃，光照強度1700～1800lx，光照周期比10h:14h。

8.根據權利要求1所述的樟葉越桔的組織培養方法，其特征在于：還包括咖啡酰熊果苷含量的測定。

9.根據權利要求8所述的樟葉越桔的組織培養方法，其特征在于：咖啡酰熊果苷含量的測定方法包括如下步驟：

(1)將樣品在自然條件下風干、粉碎后稱取0.5g置于10mL容量瓶中，加入60％甲醇10mL，稱重，超聲3次，每次30min，靜置24h后用60％甲醇補足至前面所稱重量，過微孔濾膜d＝0.45μm，得供試樣品溶液；

(2)高效液相色譜測定咖啡酰熊果苷的含量，條件如下：色譜柱Agilent?Analytical?Eclipse?XDB-C18(4.6mm×150mm，0.5μm)，流動相：甲醇/水體系(含冰醋酸1％)，洗脫體系：0～5min5％甲醇，5～10min5％～15％甲醇，10～50min15％～65％甲醇，50～55min65％～95％甲醇，流速：1.0mL/min，進樣量40μL，檢測波長280nm，柱溫30℃；通過咖啡酰熊果苷標準品的面積外標法進行含量測定，對照品線性方程為y＝1152.3x+190.03，R²＝0.9998。