[發明專利]一種骨干質粒載體及應用

有效

• 申請號: 201410225914.8
• 申請日: 2014-05-23
• 公開（公告）號: CN103981216A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 魏鵬程;楊劍波;秦瑞英;李莉;李浩;馬卉;陸徐忠;楊亞春;倪大虎;倪金龍;宋豐順
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/66;C12N1/21;A01H5/00;C12R1/01
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

技術領域

本發明屬于作物基因工程領域，具體涉及到一種用于作物基因打靶的骨干質粒載體及其在基因改造中的應用。

背景技術

我國是一個農業大國，主要農產品的持續穩定增產對保障我國糧食安全具有十分重要的戰略意義。種子是糧食生產的源頭，優良的品種是確保農業高產、優質、穩產的重要基礎。隨著國民經濟的不斷發展，人口數目的持續增加和極端天氣的頻繁出現，加快品種改良對穩定農產品產量并滿足時代發展對現代農業的需要至關重要。從上世紀中葉開始，以常規雜交選擇為代表的傳統育種技術培育了大量優良的品種，為農作物持續增產起到了重要作用。但隨著重要基因資源不斷的消耗，傳統育種技術的瓶頸效應愈加顯著。由于傳統育種技術所具有的受生殖隔離限制、易受不良基因連鎖影響、不同優勢形狀疊加的理論不清楚和周期長、成本高等不足，嚴重影響了突破性品種的選育速度。隨著生物技術的不斷發展，使用現代分子生物學手段直接精確改造形狀相關基因，發展具有簡單、快速、高效的新型改良手段，能夠有效克服傳統技術的不足，從而保障農作物品種持續和可持續的改良。

基因打靶技術是目前被認為最具有潛力的分子育種手段之一。基因打靶方法包括同源重組技術、鋅指核酸酶技術(ZFN)和類轉錄因子激活物技術(TALEN)，和最近發展出CRISPR/Cas9技術等。其中，前三者都具有打靶效率低，基因工程載體構建復雜，周期長，成本高等技術問題，影響了基因打靶技術在作物育種改良過程中的實用性。而CRSIPR/Cas9系統具有通量高、操作簡單、打靶效率高等優點，是一種理想的基因打靶方法。目前，在酵母、人類細胞、小鼠、果蠅、大鼠、斑馬魚等物種中都已成功實現了基因組的CRISPR/Cas9定向基因打靶。在植物中，也有利用CRISPR/Cas9系統進行基因組編輯的研究。但是，在關于水稻方面的研究中，目前有限的報道主要側重于機理研究，尚沒有對作物CRISPR/Cas9載體工程化優化改造，使之適于簡單快速操作的報道。

發明內容

本發明提供了一種用于作物基因打靶的基因工程骨干載體，其能夠用于進行簡單、快捷的基因打靶。

具體而言，一方面，本發明提供了一種骨干質粒載體，其特征在于，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示。

另一方面，本發明提供一種骨干質粒載體，其特征在于，所述骨干質粒載體包含向導RNA表達框和Cas9核酸酶表達框，所述向導RNA表達框的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第107至1944位所示，所述Cas9核酸酶表達框的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第1987至8635位所示。

優選地，所述向導RNA表達框包括：小麥TaU3p啟動子、壯觀霉素抗性基因SpR、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T終止子，其中，所述小麥TaU3p啟動子的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第107至631位所示，壯觀霉素抗性基因SpR的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第691至1701位所示，人工合成的sgRNA骨架序列的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第1853至1936位所示，Poly-T終止子的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第1937至1944位所示；

所述Cas9核酸酶表達框包括ZmUBI啟動子、植物偏好密碼子改造后的Cas9編碼序列和35s終止子，其中，ZmUBI啟動子的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第1987至4018位所示，Cas9編碼序列的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第4037至8308位所示，35s終止子的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第8309至8635位所示。

優選地，所述骨干質粒載體還包括T-DNA的左、右邊界序列，其中所述左邊界的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第10884至10907位所示，所述右邊界的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第1至25位所示；所述向導RNA表達框和所述Cas9表達框位于所述左邊界和所述右邊界之間。

優選地，在所述骨干質粒載體的骨架上具有卡那霉素抗性基因結構。

本發明的骨干質粒載體文中稱為pHUN4c22。

另一方面，本發明提供一種利用所述的骨干質粒載體構建重組載體的方法，其特征在于，所述構建方法包括：

按照目的基因的編碼序列，選擇雙鏈靶標片段，以整合到所述骨干質粒載體中，與sgRNA骨架序列連接形成帶有所述標靶片段的向導RNA，