[發(fā)明專利]一種骨干質(zhì)粒載體及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410225914.8
• 申請日: 2014-05-23
• 公開（公告）號: CN103981216A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏鵬程;楊劍波;秦瑞英;李莉;李浩;馬卉;陸徐忠;楊亞春;倪大虎;倪金龍;宋豐順
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/66;C12N1/21;A01H5/00;C12R1/01
• 代理公司: 北京律譜知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

1.一種骨干質(zhì)粒載體，其特征在于，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示。

2.一種骨干質(zhì)粒載體，其特征在于，所述骨干質(zhì)粒載體包含向?qū)NA表達(dá)框和Cas9核酸酶表達(dá)框，所述向?qū)NA表達(dá)框的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第107至1944位所示，所述Cas9核酸酶表達(dá)框的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第1987至8635位所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的骨干質(zhì)粒載體，其特征在于，

所述向?qū)NA表達(dá)框包括：小麥TaU3p啟動(dòng)子、壯觀霉素抗性基因SpR、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T終止子，其中，所述小麥TaU3p啟動(dòng)子的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第107至631位所示，壯觀霉素抗性基因SpR的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第691至1701位所示，人工合成的sgRNA骨架序列的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第1853至1936位所示，Poly-T終止子的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第1937至1944位所示；

所述Cas9核酸酶表達(dá)框包括ZmUBI啟動(dòng)子、植物偏好密碼子改造后的Cas9編碼序列和35s終止子，其中，ZmUBI啟動(dòng)子的核苷酸序列如SeqID?No.1第1987至4018位所示，Cas9編碼序列的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第4037至8308位所示，35s終止子的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第8309至8635位所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的骨干質(zhì)粒載體，其特征在于，

所述骨干質(zhì)粒載體還包括T-DNA的左、右邊界序列，其中所述左邊界的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第10884至10907位所示，所述右邊界的核苷酸序列如Seq?ID?No.1第1至25位所示；所述向?qū)NA表達(dá)框和所述Cas9表達(dá)框位于所述左邊界和所述右邊界之間。

5.利用權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的骨干質(zhì)粒載體構(gòu)建重組載體的方法，其特征在于，所述方法包括：

按照目的基因的編碼序列，選擇雙鏈靶標(biāo)片段，以整合到所述骨干質(zhì)粒載體中，與sgRNA骨架序列連接形成帶有所述標(biāo)靶片段的向?qū)NA，

其中，所述靶標(biāo)片段位于所述目的基因上，所述雙鏈靶標(biāo)片段的一條鏈具有5’-(N)_X-NGG-3’結(jié)構(gòu)，其中(N)_X表示數(shù)目為X的一條堿基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一個(gè)表示堿基A、G、C、T中的任意一個(gè)，NGG中的N也為堿基A、G、C、T中的任意一個(gè)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，

所述方法包括：按照靶標(biāo)序列的核酸排列順序，分別合成具有5’-AGCG-(N)_X-3’特征的正向寡核苷酸鏈和具有5’-AAAC-(N)_X-3’特征的反向寡核苷酸鏈，其中所述正向寡核苷酸鏈中的(N)_X和反向寡核苷酸中的(N)_X具有反向互補(bǔ)特征；

用BsaI內(nèi)切酶切開所述骨干質(zhì)粒載體，用所述正向寡核苷酸鏈和所述反向寡核苷酸鏈退火后形成的雙鏈核苷酸替換壯觀霉素抗性基因，通過Kana霉素正向選擇和壯觀霉素負(fù)向選擇，篩選形成用于作物目的基因打靶的重組載體。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法構(gòu)建的重組載體在作物基因打靶中的應(yīng)用，其特征在于，其包括如下步驟：

將所述重組載體轉(zhuǎn)入作物細(xì)胞，使細(xì)胞同時(shí)含有針對靶標(biāo)基因的向?qū)NA和Cas9核酸酶；在向?qū)NA和Cas9核酸酶的共同作用下，對目的基因的雙鏈靶標(biāo)片段進(jìn)行剪切，誘發(fā)作物細(xì)胞自身的DNA修復(fù)功能，實(shí)現(xiàn)目的基因中靶標(biāo)片段的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用用于獲得帶有目的基因中靶標(biāo)片段上的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失的作物植株，其包括利用所述作物細(xì)胞再生植株。

9.一種宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含權(quán)利要求5中所述的重組載體。