[發(fā)明專利]識別微絲菌用熒光探針的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410225878.5
• 申請日: 2014-05-26
• 公開（公告）號: CN104017570A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 費(fèi)學(xué)寧;朱慧芳;馬華繼;郝亞超;曹凌云;谷迎春
• 申請（專利權(quán)）人: 天津城建大學(xué)
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C09B23/10;G01N21/64
• 代理公司: 天津才智專利商標(biāo)代理有限公司 12108
• 代理人: 呂志英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于用于污水處理領(lǐng)域中微生物檢測用熒光探針的制備方法，具體涉及一種鹵代長碳鏈化合物修飾咔唑吡啶苯乙烯類菁染料得到識別微絲菌用熒光探針的制備方法。

背景技術(shù)

自活性污泥法誕生一個多世紀(jì)以來，污泥膨脹問題就一直是困擾污水處理廠正常運(yùn)行的一個世界性難題。活性污泥膨脹由絲狀菌過度生長引起的絲狀膨脹和非絲狀膨脹，其中前者占主導(dǎo)，據(jù)報道約有90％的污泥膨脹問題是由活性污泥中絲狀菌的大量生長而引起的。人們對絲狀膨脹及其關(guān)鍵菌群的研究集中在2個方面：一是引發(fā)絲狀膨脹的關(guān)鍵菌群本身的研究，包括其分離鑒定、生理生態(tài)特性、以及污泥體系中相關(guān)絲狀菌群的識別與定量表征等等；其二是從工藝操作角度探討工藝操作條件對絲狀菌群的影響，尋求控制污泥膨脹的對策。

微絲菌是污泥起泡和膨脹過程中最常見的一種絲狀菌，特別是涉及營養(yǎng)物去除的污水處理系統(tǒng)中，因而對這類絲狀菌進(jìn)行鑒別研究，對污泥膨脹現(xiàn)象的預(yù)警和控制具有重要意義。傳統(tǒng)鑒別方法主要是根據(jù)微絲菌的形態(tài)學(xué)特征和染色反應(yīng)狀態(tài)來進(jìn)行。但由于微絲菌較難分離和純培養(yǎng)，人們對其代謝和生理生態(tài)特性了解較少。近年來，隨著PCR、核酸測序等相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，采用熒光原位雜交(fluorescence?in?situ?hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)對微絲菌進(jìn)行鑒別，避免了傳統(tǒng)的方法進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)的局限性，且測定過程中細(xì)胞形態(tài)不被破壞，能夠真實(shí)反映自然環(huán)境下微生物的情況及分布等特點(diǎn)。但是，F(xiàn)ISH只能對已知核酸序列的微生物進(jìn)行標(biāo)識，且FISH方法存在細(xì)胞穿透率較低、低rRNA含量以及存在微生物自身熒光的影響和熒光褪色等缺點(diǎn)。

J.L.Nielsen等人采用熒光微球法對微絲菌進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)微絲菌表面具有一定的疏水性。利用它的這一特性，本申請中采用長碳鏈化合物對熒光染料進(jìn)行修飾，構(gòu)建一種具有長疏水鏈的熒光探針，使其與微絲菌結(jié)合，從而達(dá)到熒光識別微絲菌的目的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種識別微絲菌用熒光探針的制備方法，利用鹵代長碳鏈化合物對熒光染料進(jìn)行修飾，使制得的熒光探針具有長疏水鏈，能與具有疏水表面的微絲菌結(jié)合，從而達(dá)到識別微絲菌的目的。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種識別微絲菌用熒光探針的制備方法，該方法是采取將咔唑吡啶苯乙烯類菁染料的合成和修飾同步化的合成路線，先引入鹵代長碳鏈化合物對其4-甲基吡啶部分進(jìn)行修飾，而后再與3-甲酰基-N-乙基咔唑部分反應(yīng)，制得具有長疏水鏈的熒光探針，包括以下步驟：

(1)長鏈烷基-4-甲基吡啶鹵化鹽的合成

在圓底燒瓶中分別加入0.8-1.5份4-甲基吡啶，0.7-1.3份鹵代長碳鏈化合物及28份甲苯，磁力攪拌充分溶解進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為120℃，待反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，去除上層甲苯得到油狀物，并用正己烷洗滌，最后將洗滌完的油狀物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行減壓蒸餾，得到長鏈烷基-4-甲基吡啶鹵化鹽；

(2)3-甲酰基-N-乙基咔唑的合成

在圓底燒瓶中加入三氯氧磷20份，在冰水浴冷卻攪拌條件下，向圓底燒瓶中依次滴加DMF19-22份，65份含3-3.5份N-乙基咔唑的1,2-二氯乙烷溶液，滴畢，回流反應(yīng)8h，反應(yīng)液冷卻至室溫，并倒入冰水中，攪拌，用二氯甲烷萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行減壓蒸餾后，經(jīng)柱層析分離得3-甲酰基-N-乙基咔唑；

(3)熒光探針的合成

將步驟(1)中制備的長鏈烷基-4-甲基吡啶鹵化鹽溶于70份無水乙醇中，并加入0.9-1.3份步驟(2)中制備的3-甲酰基-N-乙基咔唑，滴加3-5滴哌啶，回流反應(yīng)12h,得到紅色溶液，反應(yīng)液濃縮后，加入乙醚析出沉淀，抽濾，制得濾餅，將濾餅在甲醇中重新結(jié)晶，得具有長疏水鏈的熒光探針。

本發(fā)明的效果為：

(1)所制備的熒光探針，是在咔唑吡啶苯乙烯類菁染料的合成路線中，先引入鹵代長碳鏈化合物對其4-甲基吡啶部分進(jìn)行修飾，而后再與3-甲酰基-N-乙基咔唑部分反應(yīng)，從而制備得到鹵代長碳鏈修飾的熒光探針，這一制備方法實(shí)現(xiàn)了咔唑吡啶苯乙烯類菁染料的合成和修飾的同步化，且該制備方法簡單，制得的熒光探針背景干擾小，熒光強(qiáng)度高，熒光性質(zhì)穩(wěn)定。

(2)鹵代長碳鏈化合物的修飾使得制備的熒光探針具有長疏水鏈，能與具有疏水表面的微絲菌結(jié)合，從而達(dá)到熒光識別微絲菌的目的。

附圖說明

圖1為本發(fā)明熒光探針與微絲菌熒光下作用關(guān)系的鏡檢圖；

圖2為本發(fā)明熒光探針與微絲菌自然光下作用關(guān)系的鏡檢圖。