[發明專利]美人魚發光桿菌快速檢測引物、試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201410225271.7
• 申請日: 2014-05-26
• 公開（公告）號: CN103981270A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 徐曉麗;姚學良;邵蓬;張勤;張振奎
• 申請（專利權）人: 天津市水產技術推廣站
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明涉及一種美人魚發光桿菌快速檢測試劑盒及其檢測方法，具體是一種采用環介導等溫擴增技術對養殖魚類致病菌進行快速檢測的試劑盒及其檢測方法，屬于水產病原菌快速檢測領域。

背景技術

美人魚發光桿菌殺魚亞種(Photobacterium?damselae?subsp.piscicida)為一種具溶血性的革蘭氏陰性短桿菌，有莢膜，曾被稱為殺魚巴斯德氏菌(Pasteurella?piscicida)、美人魚弧菌(Vibrio?damsela)，寄生感染宿主不具特異性，對多種養殖魚類均有高致病性，可引起美洲狼鱸、斑點叉尾鮰、日本五條鰤、軍曹魚、黃尾鰤、金頭鯛等發病，在國內，已從發病的大黃魚、半滑舌鰨、卵形鯧鲹、東星斑、龍膽石斑魚等分離到該菌，是養殖魚類的重要致病菌之一，具有很強的傳染性，一旦發病，可造成很高的死亡率。由于水產動物特定的生活環境和生理特性，病害一旦發生，很難控制，往往造成巨大的經濟損失，因此對于水產動物疾病，病原的早期檢測與及時有效的預防治療尤為重要。目前對于魚類美人魚發光桿菌的檢測，主要采用傳統的細菌分離鑒定，血清學反應及PCR檢測技術尚未建立，細菌分離鑒定耗時長，成本高，多以殺死水產動物為前提，操作復雜，需要專業的儀器設備和技術人員，養殖生產中急需一種能夠應用于養殖現場的、快速準確、操作簡便的美人魚發光桿菌檢測技術及其產品。

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated?Isothermal?Amplification，LAMP)是2000年建立的一種新型核酸等溫擴增技術，其特征是針對靶基因的6個區域設計4條特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，在等溫條件(60～65℃)放置30～60min即可完成核酸擴增反應，反應液中加入核酸染料SYBR?Green?I或鈣黃綠素，若有核酸擴增即可顯示顏色反應，即時得到檢測結果。LAMP的核心技術為特異性基因片段的選取及其引物的設計，引物不同，所建立的LAMP檢測技術在反應準確性、特異性、靈敏性方面也有所不同。目前尚未有關于美人魚發光桿菌LAMP檢測技術的報道。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種美人魚發光桿菌快速檢測引物。

本發明的第二個目的是提供一種能應用于現場檢測的一種美人魚發光桿菌快速檢測試劑盒。

本發明的第三個目的是提供一種檢測過程能夠快速有序進行，2h內即可完成所有檢測操作，實現了檢測過程的程序化和標準化，操作規范，對魚體損傷小的、操作簡便的不易出錯的一種美人魚發光桿菌快速檢測試劑盒的應用。

本發明的技術方案概述如下：

一種美人魚發光桿菌快速檢測引物，是由外引物和內引物組成，所述外引物由SEQ?ID?NO.1所示的外引物上游引物和SEQ?ID?NO.2所示的外引物下游引物組成；所述內引物由SEQ?ID?NO.3所示的內引物上游引物和SEQ?ID?NO.4所示的內引物下游引物組成。

一種美人魚發光桿菌快速檢測試劑盒，包括：

(1)樣品預處理液，其組成為pH＝8.0的20mmol/L?Tris-HCl，2mmol/L?EDTA，體積濃度為1.2％Triton?X-100，溶劑是蒸餾水；

(2)DEPC水；

(3)LAMP反應液，24μl?LAMP反應液的組成為：2.5μl10×反應緩沖液；3μl濃度為2.5mmol/L的dNTP；1μl濃度為8U/μl的Bst?DNA聚合酶；1μl濃度為5μmol/L的由SEQ?ID?NO.1所示的外引物上游引物，1μl濃度為5μmol/L的由SEQ?ID?NO.2所示的外引物下游引物，1μl濃度為40μmol/L的由SEQ?ID?NO.3所示的內引物上游引物，1μl濃度為40μmol/L的由SEQ?ID?NO.4所示的內引物下游引物；4μl1.6mol/L的甜菜堿；1μl鈣黃綠素與錳離子形成的配合物、8.5μl?DEPC水；

(4)陽性對照液，所述陽性對照液為1μg/ml的美人魚發光桿菌基因組DNA；

(5)無菌封裝的FTA膜片、研磨棒若干。

上述一種美人魚發光桿菌快速檢測試劑盒的應用，包括如下步驟：

(1)取待檢樣品組織加入100μl樣品預處理液，研磨棒研磨，煮沸后靜置10min，得到上清液；

(2)將FTA膜片在步驟(1)獲得的上清液中充分潤濕后室溫干燥；另取兩片FTA膜片分別在DEPC水、陽性對照液中充分潤濕后室溫干燥，作為陰性對照膜片和陽性對照膜片；