[發(fā)明專利]芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410225175.2
• 申請日: 2014-05-26
• 公開（公告）號: CN103980535B
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊軍;汪祥燕;楊宇;于憶瀟
• 申請（專利權(quán)）人: 北京航空航天大學
• 主分類號: C08J11/10
• 分類號: C08J11/10;C12N9/02;C12R1/07
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，屬于微生物發(fā)酵和固體廢物生物降解的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

塑料廢棄物是目前非常嚴重的固體廢物污染問題，它正以每年4000萬t的速度在環(huán)境中積累，造成嚴重的生態(tài)環(huán)境污染。聚乙烯-[CH₂-CH₂]_n-是日常生活中最常用的高分子材料之一，大量用于制造塑料袋、塑料薄膜及牛奶桶的產(chǎn)品等，被廣泛應用于國民經(jīng)濟和人類生活的各個方面。由于其長鏈、疏水大分子結(jié)構(gòu)特點，一般認為聚乙烯在自然環(huán)境中的生物降解過程是極其緩慢的。長期以來，各國研究者都在努力探索有效的聚乙烯生物降解方法和途徑。

高分子的生物降解是指微生物或酶切斷聚合物分子鏈，在分子鏈水平上利用生化過程降解大分子的方法。目前，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些真菌和細菌等微生物具有降解聚乙烯的作用：這些微生物能夠利用聚乙烯作為唯一碳源生長，使聚乙烯表面產(chǎn)生明顯的侵蝕。此外，少數(shù)報道表明鏈霉菌胞外酶、真菌木質(zhì)素錳過氧化物酶和紅球菌漆酶對預處理聚乙烯(UV或改性劑處理)有氧化降解的潛力，大豆過氧化物酶和細菌單加氧酶對未處理聚乙烯具有氧化降解的潛力。

漆酶是一種含銅的氧化還原酶，廣泛存在于植物、動物和微生物(真菌和細菌)中。漆酶具有較強的催化氧化能力，能催化氧化降解多種難降解的有機物，包括農(nóng)藥、多環(huán)芳烴(PAHs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、酚類、苯胺類及蒽醌類等，尤其對天然高分子木質(zhì)素的降解研究的比較多。當漆酶催化底物氧化時，漆酶利用氧分子作為電子受體，從被氧化的底物分子中通過單電子提取方式去除一個氫原子，形成相應的底物自由基，這些自由基不穩(wěn)定會進一步發(fā)生水合作用、歧化作用等非酶促反應，從而氧化芳基-烷基及其側(cè)鏈烷基的C-C鍵等。聚乙烯由長鏈C-C鍵鏈接而成，漆酶的這些催化特性使得其也可能具有氧化降解聚乙烯的能力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明可通過以下方式得以實現(xiàn)：

在選定的培養(yǎng)基中接種芽孢桿菌YP1(CGMCC6318，)種子液，在適宜的產(chǎn)酶條件下發(fā)酵，通過一定的方法分離濃縮得到漆酶，再將酶用于降解聚乙烯薄膜，在適宜條件下作用一定時間后取出樣品，洗凈后表征酶降解效果。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為(g/L)：葡萄糖20，KH₂PO₄0.7，K₂HPO₄0.7，MgSO₄·7H₂O0.7，NaNO₃2.0，NaCl0.005，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.002，ZnSO₄·7H₂O0.002，MnSO₄·H₂O0.001，CuSO₄·5H₂O0～0.005，pH自然。

產(chǎn)酶工藝：在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，加入培養(yǎng)24h的芽孢桿菌YP1(接種濃度2×10⁵CFU/mL)，37℃、125r/min震蕩培養(yǎng)2～10d。發(fā)酵液離心后收集上清液，以85％飽和度硫酸銨沉淀，4000rpm冷凍離心40min后得到蛋白質(zhì)沉淀，以高純水重懸浮配，Mw3500Da透析除鹽和離心除變性蛋白后以丁香醛連氮測定漆酶活力。當培養(yǎng)基中不含Cu²⁺時，上清液中基本無漆酶活性；當培養(yǎng)基中Cu²⁺濃度為10μM，培養(yǎng)6d時菌株YP1產(chǎn)漆酶活性最大。漆酶的最適反應溫度和pH分別為60℃和5.0。可將冷凍干燥后得到的酶粉在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將上述得到的酶粉加高純水溶解，測定濃度。將聚乙烯薄膜裁成1.5cm×1.0cm和1.5cm×0.5cm尺寸的小片(約100mg)加入到磷酸鹽緩沖液(100mM，pH7.0)中，加入酶液(約0.92mg)用以處理聚乙烯薄膜，37℃、125r/min震蕩下反應4d。

反應結(jié)束后取出聚乙烯小片，首先用1％SDS溶液浸泡30min，然后用蒸餾水徹底沖洗，自然干燥。分別以水接觸角(WCA)、ATR-FTIR和SEM方法表征漆酶對聚乙烯的降解效果。

本發(fā)明具有以下特點：

1.在分離過程中，采用各種濃縮方法相結(jié)合，提高了實驗室條件下大量培養(yǎng)菌株分離胞外酶的效率。

2.胞外酶的生產(chǎn)分離及酶對聚乙烯的處理過程不需要特殊的儀器，易操作。