[發明專利]檢測豬流行性腹瀉病毒抗體的ELISA試劑盒

無效

• 申請號: 201410224227.4
• 申請日: 2014-05-26
• 公開（公告）號: CN103969450A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 李彬;孫冰;何孔旺;杜露平;郭容利;倪艷秀;溫立斌;俞正玉;張雪寒;茅愛華;呂立新;胡屹屹;周俊明;王小敏;祝昊丹;于洋
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

技術領域

本發明涉及一種豬流行性腹瀉病毒抗體的ELISA試劑盒及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）引起的一種急性、高度接觸性的傳染病，常以急性腸炎和伴有脫水的水樣腹瀉為特征，各種年齡的豬均易感和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病。2010年冬季至2011年春季全國各地豬場的豬群中先后發生嚴重的傳染性腹瀉疾病，發病突然，傳播較快，流行范圍廣，流行時間長，應用各種抗生素防治無效，其發病率與死亡率很高，造成重大的經濟損失。經研究表明，豬流行性腹瀉病毒是此次疫情的元兇。此后該病在我國豬群中廣泛流行。

目前對于PEDV的診斷主要是依靠RT-PCR方法，該方法對實驗設備和條件要求較高，不適合臨床上的大規模快速診斷。應用各種免疫血清學技術對疫病做出準確、迅速的診斷是預防和控制該病的重要措施之一。ELISA法具有簡便、快速、特異性強等優點，而且ELISA檢測抗體能夠評價疫苗的免疫效果，但需要抗原純度較高且免疫原性良好。PEDV N蛋白是由441個氨基酸組成、分子質量為55～58 ku、磷酸化的核衣殼蛋白，與病毒基因組RNA相互纏繞形成病毒核衣殼，在病毒RNA合成過程中發揮著重要的作用，它能與細胞膜和磷脂結合，促進病毒的組裝和RNA復制體的形成。并且N蛋白在PEDV的結構蛋白中所占的比例最大，在感染的細胞中能得到大量表達。豬在感染PEDV的早期體內就能產生抗N蛋白的高水平抗體。冠狀病毒N 蛋白又十分保守, 所以利用N蛋白來建立PEDV分子生物學診斷技術具有很好的應用前景。

發明內容

技術問題

本發明基于上述豬流行性腹瀉病毒的特點與研究結果，提供了一種檢測PEDV抗體的ELISA試劑盒及其應用。該試劑盒成本低廉、操作簡便，為PEDV的檢測提供了一種快捷易用的血清學診斷方法，市場前景良好。

技術方案

本發明的目的是通過如下技術方案實現的：

本發明提供一種豬流行性腹瀉病毒PEDV重組N蛋白，其制備方法包括以下步驟：

（1）以豬流行性腹瀉病毒RNA作為材料，通過RT-PCR方法擴增獲得其N基因(登錄號KC210145)，擴增片段大小為1326 bp，并以pET-28a質粒作為載體構建重組質粒pET-28a-N。N基因與pET-28a載體分別用BamH I與Sal I雙酶切后，連接構建重組質粒pET-28a-N，雙酶切鑒定重組質粒。

（2）將陽性重組表達質粒pET-28a-N轉化BL21（DE3）感受態細胞，獲得陽性質粒菌單克隆pET-28a-N/BL21。該單克隆于37℃培養，待A600值達到0.4~0.6時，加入IPTG至終濃度為0.8mmol/L進行誘導表達，收集誘導表達后5h的菌體，進行SDS-PAGE鑒定。取誘導表達后5h的菌體，超聲破碎，離心后分別取上清與沉淀進行SDS-PAGE電泳鑒定。根據電泳結果，取上清表達液進行Western blot鑒定。大量誘導表達N蛋白，超聲破碎，取上清表達液，使用Ni-TED柱進行純化，收集上清濾過液、LEW洗滌Ni-TED柱所得洗滌液、1xElution Buffer洗脫所得純化蛋白。

所述PEDV重組N蛋白用于制備檢測豬流行性腹瀉病抗體的ELISA試劑盒，包括以下組分：

（1）ELISA板條：以所述豬流行性腹瀉病毒PEDV重組N蛋白作為包被抗原，ELISA板條經5%（M/V）脫脂乳封閉，以包裝袋密封包裝于4℃保存。

（2）洗滌液：含0.05%吐溫-20的pH7.4 磷酸鹽緩沖液（PBS-T）；

（3）血清稀釋液：5%（M/V）脫脂乳；

（4）底物顯色液：已加入H₂O₂的TMB溶液；

（5）羊抗豬酶標二抗：已用血清稀釋液稀釋至工作濃度1:10000的羊抗豬酶標二抗；

（6）終止液：2M H₂SO₄溶液；

（7）PEDV陽性血清

（8）PEDV陰性血清

所述ELISA試劑盒在檢測豬流行性腹瀉病時，主要操作步驟如下：

（1）加入血清樣品：