[發明專利]檢測豬流行性腹瀉病毒抗體的ELISA試劑盒

無效

• 申請號: 201410224227.4
• 申請日: 2014-05-26
• 公開（公告）號: CN103969450A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 李彬;孫冰;何孔旺;杜露平;郭容利;倪艷秀;溫立斌;俞正玉;張雪寒;茅愛華;呂立新;胡屹屹;周俊明;王小敏;祝昊丹;于洋
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1. 豬流行性腹瀉病毒PEDV重組N蛋白，其制備方法包括以下步驟：

（1）以豬流行性腹瀉病毒PEDV的RNA作為材料，通過RT-PCR方法擴增獲得其N基因，基因登錄號KC210145，擴增片段大小為1326bp，并以pET-28a質粒作為載體構建重組質粒pET-28a-N，N基因與pET-28a載體分別用BamH I與Sal I雙酶切后，連接構建重組質粒pET-28a-N，雙酶切鑒定重組質粒；

將陽性重組表達質粒pET-28a-N轉化BL21（DE3）感受態細胞，獲得陽性質粒菌單克隆pET-28a-N/BL21；該單克隆于37℃培養，待A600值達到0.4~0.6時，加入IPTG至終濃度為0.8mmol/L進行誘導表達，收集誘導表達后5h的菌體，進行SDS-PAGE鑒定，取誘導表達后5h的菌體，超聲破碎，離心后分別取上清與沉淀進行SDS-PAGE電泳鑒定，根據電泳結果，取上清表達液進行Western blot鑒定，大量誘導表達N蛋白，超聲破碎，取上清表達液，使用Ni-TED柱進行純化，收集上清濾過液、LEW洗滌Ni-TED柱所得洗滌液、1xElution Buffer洗脫所得純化蛋白。

2.用權利要求1所述PEDV重組N蛋白制備的豬流行性腹瀉病毒抗體檢測ELISA試劑盒，包括以下組分：

（1）ELISA板條：以權利要求1所述PEDV重組N蛋白作為包被抗原，ELISA板條經5%（M/V）脫脂乳封閉，以包裝袋密封包裝于4℃保存；

（2）洗滌液：含0.05%吐溫-20的pH7.4 磷酸鹽緩沖液PBS-T；

（3）血清稀釋液：5%（M/V）脫脂乳；

（4）底物顯色液：已加入H₂O₂的TMB溶液；

（5）羊抗豬酶標二抗：已用血清稀釋液稀釋至工作濃度1:10000的羊抗豬酶標二抗；

（6）終止液：2M H₂SO₄溶液；

（7）PEDV陽性血清；

（8）PEDV陰性血清。

3.根據權利要求2所述ELISA試劑盒，其在檢測豬流行性腹瀉病毒抗體時，主要操作步驟如下：

（1）加入血清樣品：

用血清稀釋液5%（M/V）脫脂乳將待檢血清做1:50稀釋后，每孔加入100μL，每一血清樣品添加兩孔，同時設立PED陰、陽性血清作為對照，各添加兩孔；室溫下作用60分鐘，棄去反應孔中的液體：每個孔用200μL洗滌液充分清洗3次，每次5分鐘，每次洗滌后將反應孔中的液體除去，最后一次除去洗滌液后，充分除去殘留的液體；

加入羊抗豬酶標二抗：

每孔加入100μL羊抗豬酶標二抗，室溫作用30分鐘，如步驟（1）中方法洗滌；

加入底物顯色液：

每孔加入100μL已加入H₂O₂的TMB溶液，室溫下避光作用15分鐘；

終止反應：

每孔加入100μL 2M H₂SO₄終止液，終止顯色反應；

用酶標儀測定OD值：

使用酶標儀在450nm波長下測定各孔吸光光度（OD）值；

結果判定：

間接ELISA檢測時加入標準陽性血清，用酶標儀在450nm波長下測定OD值，計算各份血清OD₄₅₀與標準陽性血清OD₄₅₀的比值S/P，當樣品S/P值≥ 0.26時為陽性，＜0.26時為陰性。