[發明專利]一種利用SNP開發與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標記的方法

有效

• 申請號: 201410220172.X
• 申請日: 2014-05-22
• 公開（公告）號: CN103966335A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 鄧志英;田紀春;陳芳;李文靜;陳建省
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及一種利用SNP開發與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標記的方法，屬于小麥分子生物技術與分子標記應用技術領域。

背景技術

小麥是異源六倍體，基因組結構復雜，每個基因組上存在的分子標記的多態也有較大差異。通過前人構建的分子遺傳圖譜發現A、B基因組上分子標記較多，而D基因組各個染色體上的標記較少，尤其是4D和5D染色體，這也為存在這些染色體上控制重要性狀的基因的克隆帶來了較大的困難。因此，開發4D和5D染色體上新的分子標記不僅能夠加密飽和分子遺傳圖譜，而且對克隆控制重要性狀(如矮敗不育性狀、抽穗期等性狀)的基因奠定良好的基礎。

在各類分子標記中，基于PCR的SSR(simple sequence repeat)標記及其豐富，且廣泛分布于基因組中。因具有超變異性及位點專一性、共顯性和多等位基因等優越性得到廣泛應用。但由于受小麥基因組測序困難的限制，以前的SSR標記只能計算出遺傳位置，沒有確定的物理位置，不利于基因的精細定位及克隆。

但隨著A基因組和D基因組測序工作的完成，以及D基因組物理圖譜的構建為開發物理位置確定的SSR標記提供了幫助，但目前仍然沒有一種有效的SSR標記定位方法。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種利用SNP開發與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標記的方法。

本發明技術方案如下：

一種利用SNP開發與SNP緊密連鎖的SNP-SSR分子標記的方法，步驟如下：

(1)根據待開發樣品的已知SNP分子標記在遺傳圖譜上的位置確定該標記所在區段對應的已知遺傳物理圖譜的近緣物種的位置，查找獲得SNP標記延伸序列；

(2)將步驟(1)的SNP標記延伸序列在待開發樣品的基因組測序數據庫進行比對，根據相似度≥99％的條件，選取長度范圍為50kb到100kb的序列片段；

(3)以重復序列長度≥20bp，按照二堿基重復型的重復次數不小于10次，三堿基重復型的重復次數不小于7次，四堿基重復型的重復次數不小于5次的標準，對完全型、不完全型、復合型三種SSR進行查找，獲得SSR位點；

(4)根據步驟(3)獲得的SSR位點的側翼區域設計引物，經PCR擴增和測序，選取帶型穩定清晰的，獲得待驗證分子標記；

(5)利用步驟(4)的待驗證分子標記的引物，PCR擴增不同品系的待開發樣品，選取結果具有多樣性的分子標記，制得SNP-SSR分子標記。

上述SNP標記延伸序列英文名稱：SNP extended sequences。其在Ming-Cheng Luo,Yong Q.Gu,Frank M.You,Karin R.Deal,Yaqin Mu,Yuqin Hu,Naxin Huo.Yi Wang.A4-gigabase physical map unlocks the structure and evolution of the complex genome of Aegilops tauschii,the wheat D-genome progenitor.PNAS,2013,110(19):7940-7945.中有相關的報道。

上述近緣物種為遺傳學領域專業術語，指包括祖先物種及與其有一定親緣關系的物種。

根據本發明優選的，所述的待開發樣品為小麥，所述的已知遺傳物理圖譜的近緣物種為粗山羊草。

根據本發明進一步優選的，所述的小麥的已知SNP分子標記在遺傳圖譜上的位置確定該標記所在區段對應的粗山羊草的位置，為登陸數據庫查找SNP標記延伸序列；數據庫為http://probes.pw.usda.gov/WheatDMarker/。

根據本發明進一步優選的，所述的待開發樣品為小麥D基因組。

根據本發明更優選的，所述SNP標記延伸序列在待開發樣品的基因組測序數據庫進行比對，為登陸小麥D基因組測序數據庫進行比對；