[發(fā)明專利]一種藥物靶標(biāo)捕獲方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410214864.3
• 申請日: 2014-05-21
• 公開（公告）號: CN104181221B
• 公開（公告）日: 2017-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李進;楊本艷姿;竇登峰;葛嘯虎;宋宏梅;萬金橋;張艷;胡曉;王星;馮靜超;鐘國慶
• 申請（專利權(quán)）人: 成都先導(dǎo)藥物開發(fā)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 成都高遠知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)51222
• 代理人: 李高峽,杜朗宇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種藥物靶標(biāo)的捕獲方法。

背景技術(shù)

選擇確定新穎有效的藥物靶標(biāo)是新藥開發(fā)的首要任務(wù)。藥物作用靶標(biāo)的確定，有助于更好的了解藥物在體內(nèi)的功能及作用機理，在對藥物定向合成、療效、給藥方式、藥物代謝及安全性評價方面都起著至關(guān)重要的作用?，F(xiàn)有的方法在對藥物靶標(biāo)的捕獲方法大體可分為兩種：一是從細(xì)胞表型或者功能的變化來判斷，如生物芯片和基于酵母雙雜交或三雜交的捕獲技術(shù)，但是細(xì)胞內(nèi)信號通路錯綜復(fù)雜，不同的信號分子可調(diào)節(jié)相同的細(xì)胞功能，同一信號分子在不同的信號通路中也可行使不同的作用，因此依據(jù)細(xì)胞表型或功能的變化不能明確判定細(xì)胞內(nèi)的藥物靶標(biāo)；另外一類捕獲方法是依據(jù)藥物與藥物靶標(biāo)的親和性，在細(xì)胞裂解液中用已知藥物捕獲潛在的藥物靶標(biāo)，但細(xì)胞內(nèi)不同的蛋白存在于不同的細(xì)胞器中，這些細(xì)胞器之間彼此相隔成為獨立的小室，細(xì)胞在裂解過程中將細(xì)胞內(nèi)所有的蛋白混合在一起，這樣在加入藥物后，可能正常生理狀態(tài)下藥物不會作用的靶蛋白在全細(xì)胞裂解的時候會相互作用，引起假陽性從而對藥物靶標(biāo)的捕獲造成干擾。大部分藥物需要穿過細(xì)胞膜才能進入組織細(xì)胞發(fā)揮其作用，而細(xì)胞膜這一天然屏障卻使得許多具有很好體外生物活性的分子(如極性比較高的分子)包括藥物不能進入細(xì)胞內(nèi)，以至于無法發(fā)揮其應(yīng)有的作用，從而限制了藥物的應(yīng)用。

為了解決現(xiàn)有藥物靶標(biāo)捕獲方法存在的問題，我們設(shè)計了一種新的藥物靶標(biāo)捕獲方法靶標(biāo)，即把化合物與DNA或RNA或其它特異親和材料的一方進行共價連接，再通過不損傷細(xì)胞的方式轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)部進行藥物靶標(biāo)的捕獲，然后對捕獲的靶標(biāo)進行識別和驗證。其優(yōu)勢在于靶標(biāo)捕獲的環(huán)境是在細(xì)胞內(nèi)：相對于傳統(tǒng)的先裂解細(xì)胞再捕獲靶標(biāo)的方法，本發(fā)明的化合物與靶標(biāo)結(jié)合的過程發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)部，接近于實際的生理狀態(tài)，發(fā)生結(jié)合時細(xì)胞內(nèi)蛋白能夠保持原有的構(gòu)象，因此能夠更好的模擬體內(nèi)的藥物作用過程。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種藥物靶標(biāo)捕獲方法。

本發(fā)明藥物靶標(biāo)捕獲方法，包括如下步驟：

(1)取原料：取化合物以及DNA或RNA或其它特異親和材料的一方；

(2)將化合物與DNA或RNA或其它特異親和材料的一方共價連接，得如圖1所示的標(biāo)簽化合物；

(3)轉(zhuǎn)運：用特定的基因轉(zhuǎn)運方法，將步驟(2)得到的標(biāo)簽化合物分別轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)；

(4)靶標(biāo)捕獲：將步驟(3)的細(xì)胞破碎，用固定化的互補DNA或RNA捕獲步驟(1)中的DNA或RNA、或用固定化特異親和材料的另一方來捕獲步驟(1)中的親和材料一方，從而通過共價結(jié)合的標(biāo)簽化合物與靶標(biāo)的親和力將靶標(biāo)富集。

(5)靶標(biāo)識別；將富集的靶標(biāo)從固定相上解離，用膠電泳的方法展開，用蛋白組學(xué)的方法，比較差異蛋白，從而識別潛在的靶標(biāo)。

(6)靶標(biāo)確認(rèn)，即可。

步驟(1)中所述化合物，是藥物本身或者其成分。

步驟(2)中所述標(biāo)簽化合物是指在連接了帶生物素或熒光或同位素或其它用于示蹤的標(biāo)記的DNA或RNA的化合物。

步驟(5)所述靶標(biāo)識別是將富集的靶標(biāo)從固定相上解離，用膠電泳的方法展開，用蛋白組學(xué)的方法，比較差異蛋白，從而識別潛在的靶標(biāo)。

步驟(6)所述靶標(biāo)確認(rèn)是按優(yōu)先級表達或購買(5)中識別的靶標(biāo)，并逐一通過化合物與這些靶標(biāo)的相互作用比較，最終達到化合物靶標(biāo)的確認(rèn)。

步驟(1)中，所述化合物的分子量為100～4000Da。

步驟(1)中，所述化合物為用于步驟(2)中共價連接的、經(jīng)過化學(xué)修飾并具有與靶標(biāo)化合物相似生物活性的化合物。

步驟(1)所述的DNA或RNA為在所述范圍的任意序列并具有步驟(2)中用于與化合物共價連接的官能團。

步驟(1)中，所述DNA或RNA的長度不小于5個堿基對或堿基。

步驟(1)中，所述的標(biāo)記為生物素或熒光或同位素或其它用于示蹤的標(biāo)記。

步驟(1)所述其它親和材料的一方為任意無明顯細(xì)胞毒性的、具有與步驟(2)中化合物共價連接的特異性親和材料對的一方。

步驟(2)所述的標(biāo)簽化合物為具有與待識別靶標(biāo)化合物相似活性的化合物。步驟(3)中，所述基因轉(zhuǎn)運的方法是不造成明顯細(xì)胞損傷的所有轉(zhuǎn)運方法。

步驟(3)中，所述基因轉(zhuǎn)運方法是陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣法轉(zhuǎn)染法、納米顆粒轉(zhuǎn)染法或電穿孔轉(zhuǎn)染法以及其他能夠?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)手段。

所述“基因轉(zhuǎn)運”是指使用物理、化學(xué)或者生物方法將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的過程。