[發(fā)明專利]基于ADP檢測(cè)的發(fā)光磷酸轉(zhuǎn)移酶或ATP水解酶測(cè)定

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410211148.X
• 申請(qǐng)日: 2009-07-20
• 公開（公告）號(hào): CN103983634A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: S.A.格利;H.澤佐蒂
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 普羅美加公司
• 主分類號(hào): G01N21/76
• 分類號(hào): G01N21/76
• 代理公司: 中國(guó)專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 林毅斌;權(quán)陸軍

本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2009年7月20日，申請(qǐng)?zhí)枮?00980138112.0(PCT/US2009/051170)，發(fā)明名稱為“基于ADP檢測(cè)的發(fā)光磷酸轉(zhuǎn)移酶或ATP水解酶測(cè)定”。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求于2008年7月22日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)61/082,775和2009年4月17日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)61/170,308和2009年5月29日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)61/182,372的權(quán)益，這些申請(qǐng)的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中

背景

因?yàn)檗D(zhuǎn)移酶、尤其是激酶的生理相關(guān)性、多樣性和普遍存在，它們成為生化和醫(yī)學(xué)研究中最重要并被廣泛研究的一類酶家族。研究表明蛋白激酶和脂質(zhì)激酶是許多細(xì)胞功能的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)劑，所述功能包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂以及細(xì)胞對(duì)藥物、毒素和病原體的反應(yīng)。

蛋白激酶在多種細(xì)胞事件的調(diào)節(jié)中起到至關(guān)重要的作用。這些酶的作用是通過將磷酸殘基轉(zhuǎn)移至某些胞內(nèi)多肽的氨基酸，使這些蛋白質(zhì)底物活化并發(fā)動(dòng)包括生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞分裂在內(nèi)的活化控制事件級(jí)聯(lián)。在腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)深入研究了蛋白激酶。據(jù)信，細(xì)胞中激酶受控活性的缺失導(dǎo)致形成腫瘤。制藥業(yè)一直在研究靶向這些激酶的藥物，以有助于治療各種腫瘤。有超過500種蛋白激酶(大約占2-2.5％的人類基因組)涉及細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。它們以跨膜酶和胞質(zhì)溶膠酶形式存在，并且它們使絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸氨基酸殘基磷酸化。根據(jù)這樣的底物特異性，可將激酶分為2組：絲氨酸/蘇氨酸激酶和酪氨酸激酶。

絲氨酸/蘇氨酸激酶包括環(huán)狀A(yù)MP和環(huán)狀GMP依賴型蛋白激酶、鈣和磷脂依賴型蛋白激酶、鈣和鈣調(diào)蛋白依賴型蛋白激酶、酪蛋白激酶、細(xì)胞周期蛋白激酶等。這些激酶通常是胞質(zhì)酶或可能通過錨定蛋白與特定細(xì)胞部分締合。

酪氨酸激酶使酪氨酸殘基磷酸化。這些特定激酶的存在數(shù)量非常少，但在細(xì)胞調(diào)節(jié)中卻起到同樣重要的作用。這些激酶包括某些可溶性酶例如蛋白激酶src家族和生長(zhǎng)因子受體，例如表皮生長(zhǎng)因子受體、胰島素受體、血小板衍生的生長(zhǎng)因子受體等。研究表明，許多酪氨酸激酶是跨膜蛋白，其受體結(jié)構(gòu)域位于胞外，而其激酶結(jié)構(gòu)域在胞內(nèi)。

脂質(zhì)激酶在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中也起到重要作用，可以分為4大類。示例性的脂質(zhì)激酶包括PI3激酶和磷脂酰肌醇4-激酶。

糖激酶和其它磷酸轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞代謝、增殖和細(xì)胞凋亡中也起到主要作用。

因?yàn)榱姿峄录婕叭绱酥嗟募?xì)胞功能和疾病，所以鑒定激酶活性就特別重要。目前用于檢測(cè)激酶活性的測(cè)定類型包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)測(cè)定、熒光偏振(FP)測(cè)定和基于放射性的測(cè)定例如閃爍親近測(cè)定(SPA)。用于檢測(cè)激酶活性的FRET測(cè)定是利用與熒光分子連接的蛋白質(zhì)或肽底物和另一熒光標(biāo)記的探針。這兩個(gè)熒光分子僅當(dāng)?shù)孜锉涣姿峄⒈粯?biāo)記探針識(shí)別后，才會(huì)鄰近。因此，當(dāng)被激酶磷酸化時(shí)，標(biāo)記的能量通過共振傳遞給熒光分子(受體)。能量從較高能量供體熒光團(tuán)直接傳遞到較低能量受體分子的能力，導(dǎo)致受體分子的敏化熒光并同時(shí)猝滅供體熒光。在此情況下，供體熒光因鄰近受體被“猝滅”，而供體能量以非放射性方式傳遞給受體。依照福斯特方程，能量轉(zhuǎn)移效率取決于供體和受體生色團(tuán)之間的距離。在大多數(shù)情況下，在距離大于100埃時(shí)，未觀察到FRET，因此FRET的存在是鄰近的良好指示。因此，在利用與熒光分子連接的蛋白質(zhì)或肽底物和另一熒光標(biāo)記的探針而檢測(cè)激酶活性的FRET測(cè)定中，如果激酶被抑制，兩個(gè)熒光分子仍然分開，則不發(fā)生FRET。

基于FRET的測(cè)定有很多缺陷，包括大量的假命中，例如因?yàn)閷?duì)所測(cè)化合物的熒光干擾、狹窄的動(dòng)態(tài)范圍和測(cè)定所用抗體相關(guān)的表現(xiàn)情況。