[發(fā)明專利]菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410210430.6
• 申請日: 2014-05-19
• 公開（公告）號: CN103952492A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳吳健;張明哲;林曉佳;吳志毅;陳曦
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為：本發(fā)明涉及一種檢測鑒定菊花及其產(chǎn)品中是否攜帶菊花花枯病菌(Didymella?ligulicola)的實時熒光PCR方法。

背景技術(shù)

菊花花枯病Didymella?ligulicola是菊花上的重要病害。1982年被列入EPPO檢疫性有害生物A2名單中，屬于我國的檢疫性病害。該病于1904年，美國的北卡羅那州首先發(fā)現(xiàn)并報道；隨著菊花切花和盆栽菊花的大量生產(chǎn)，危害日益嚴(yán)重，英、德、荷蘭、丹麥、加拿大、肯尼亞、坦桑尼亞、日本、澳大利亞、新西蘭等國均有發(fā)生，我國目前尚無報道發(fā)生。

該病主要侵染菊花花冠，流行快，幾天之內(nèi)可使花冠完全腐爛；也可以使切花在運銷過程中大量落花，給商品菊花造成很大的損失。而且該病對環(huán)境適應(yīng)能力很強，可以在各種惡劣自然條件下發(fā)生，尤其在溫室中，常年都可以發(fā)病，因此該病一旦定殖，將會對我國的菊花產(chǎn)業(yè)帶來毀滅性的打擊，即使花費大量的人力和財力，也很難得到根治。

目前我國菊花出口的勢頭較好，菊花是日本人祭祀祖先的專用花。由于日本國內(nèi)生產(chǎn)鮮切菊花成本高，菊花種植面積逐年減少，日本每年從我國大量進口鮮切菊花。北京、上海、江蘇、浙江、廣東直至海南生產(chǎn)的鮮切菊花都開始出口，1996年至2006年，我國出口到日本的鮮切菊花總量有3000多萬枝，為我國花卉企業(yè)帶來了很好的收益。

鑒于該病危害性嚴(yán)重、適應(yīng)性強，且我國尚無分布，加強檢疫是防止該病害傳入我國的首要手段，但鑒于切花產(chǎn)品的特殊性，檢疫周期的長短直接影響著切花產(chǎn)品的品質(zhì)，傳統(tǒng)的檢疫手段耗時長、難度大，并且無法從無癥狀植株上檢出該病，因此篩選一種適宜、準(zhǔn)確、快速的檢疫鑒定方法，已成為我國菊花生產(chǎn)，及其他菊科作物的進出口上亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種實現(xiàn)對菊花花枯病菌進行快速檢測的菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法，以待測樣品DNA為模板，利用上游引物DL1、下游引物DL2和熒光探針Probe-DL進行PCR擴增，若發(fā)生特異性擴增，則表明待測樣品中帶有菊花花枯病菌D.ligulicola；

所述上游引物DL1為：5，-CAACACTTAAACCCTTTGTAATTGA-3，

所述下游引物DL2為：5，-GGACGTCGTCGTTTTGTTGT-3，；

所述熒光探針Probe-DL為：5，-FAM-ACAACTTTCAACAACGGATC-TAMRA-3，。

作為本發(fā)明的菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法的改進：

所述PCR擴增的反應(yīng)體系(20μL)為：

所述PCR擴增的反應(yīng)條件為：

50℃預(yù)熱2min，95℃變性10min；然后進入40個循環(huán)，95℃15s，60℃1min。

作為本發(fā)明的菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法的進一步改進：PCR擴增擴增后讀取Ct值，當(dāng)Ct值為小于或等于36時，判定為發(fā)生特異性擴增，即表明待測樣品中帶有菊花花枯病菌D.ligulicola。

作為本發(fā)明的菊花花枯病菌實時熒光PCR檢測方法的進一步改進：所述待測樣品為菊花及菊花產(chǎn)品。菊花產(chǎn)品包括菊花切花、菊花切條、干制菊花茶等。

本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

1、引物和探針的設(shè)計

在NCBI的網(wǎng)站上(http://www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST/)選取了18個分別來自Didymella及Phoma屬真菌的rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal?transcribed?spacer，ITS)序列，用MegAlign軟件(version5.0；DNASTAR,Madison,WI)的ClustalV算法進行排序。在排序后的在變異區(qū)域特設(shè)了菊花花枯病菌的特異性引物和探針。引物探針序列見表1。

2、引物探針特異性的理論驗證

為了驗證探針的特異性，用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)對引物探針進行了驗證。BLAST搜索發(fā)現(xiàn)，所設(shè)計的引物和探針具有較高的特異性。發(fā)現(xiàn)該對引物只能擴增菊花花枯病菌。(其中Stagonosporopsis?ligulicola為Didymella?ligulicola的異名。)

經(jīng)過BLAST驗證，所設(shè)計的引物探針理論上具有很高特異性。

表1