[發明專利]一種檢測乳制品中大腸菌群的方法及所用引物

無效

• 申請號: 201410210385.4
• 申請日: 2014-05-19
• 公開（公告）號: CN103981266A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 安穎;齊炳理;陳世賢;張雅君
• 申請（專利權）人: 內蒙古伊利實業集團股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 韓蕾

技術領域

本發明涉及一種檢測乳制品中大腸菌群的方法及所用引物，具體是一種熒光定量PCR檢測方法及該方法中所用的特異性引物，屬于細菌檢測技術領域。

背景技術

大腸菌群(Coliform?bacteria)是一群在37℃24小時能發酵乳糖產酸產氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，主要包括腸桿菌科的四個屬即大腸埃希氏菌屬(Escherichia)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、產氣克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和陰溝腸桿菌屬(Enterobacter)。大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌。大腸菌群廣泛存在于人和溫血動物的腸道，并隨糞便分布于自然界。大腸菌群既是糞便污染的指示菌，又是腸道致病菌污染食品的指示菌，是世界上大多數國家和組織評價食品衛生質量的重要安全性指標之一，在食品微生物指標體系中占有舉足輕重的地位。

我國的食品衛生微生物標準體系主要由菌落總數、大腸菌群和致病菌三大類構成。大腸菌群的傳統檢測和計數方法有多管發酵法(MTF)和濾膜法(MF)。MTF是食品大腸菌群檢測公認的傳統方法，其原理是依據大腸菌群能夠發酵乳糖，產酸產氣的特點，將樣品進行系列倍比稀釋，接種到含有乳糖的培養基中，進行初發酵試驗，觀察產氣情況，產氣者進行復發酵試驗。MTF優點是不需昂貴的儀器設備，經過基本微生物學培訓的技術員即可操作；缺點是耗時費力，樣品需要作系列稀釋，加上復發酵試驗大約需要96h。MF已在許多國家作為水質微生物檢測的標準方法，核心是使用0.45μm的過濾膜過濾水樣，將細菌截流在膜上，然后把膜放在選擇性培養基中培養，計數膜上生長出的典型細菌集落。MF主要用于測定水中大腸菌群，雖然較MTF快，總需約48～72h，但僅適用于雜質較少的水體。

乳制品富含蛋白質、脂肪等營養物質，在生產、運輸、加工和貯藏過程中，如果操作不當，極易受到大腸菌群的污染。統計顯示，在影響中國食品安全的諸因素中，微生物污染高居首位。世界各國普遍將大腸菌群作為食品的細菌學常規檢驗指標之一，并且都對此衛生標準有明確規定，其檢測結果的準確性直接關系到產品的品質和食品企業的經濟效益，更關系到所有消費者的健康。乳制品企業大腸菌群的通用檢測方法是國標方法，經過系列稀釋、初發酵試驗、復發酵驗證等步驟，得出檢驗結果至少需要3-5天時間，對于貨架期較短的食品非常不便。因此，提高大腸菌群檢測的精確度和縮短檢測時間是控制和保障食品安全的重要手段。

自1985年聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction,PCR)技術問世以來，這一技術逐漸推廣應用于生命科學的各個領域。因其具備快速、特異、靈敏、操作簡便的特性，目前已被廣泛應用于各種致病微生物的檢測領域。但是常規PCR只能對終產物進行分析，無法對起始模板準確定量，必須在擴增反應結束后借助電泳方法分析，費時費事，無法對擴增反應實時檢測，因此常規PCR難以用于微生物的定量分析。實時熒光定量PCR技術是一種新型的核酸擴增技術，是DNA定量技術的一次飛躍，其主要是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。實時熒光定量PCR技術具有檢測精度、靈敏度高，檢測重復性好和線性范圍廣，操作簡單、安全、自動化程度高，檢測速度快、效率高等明顯的優越性，是目前世界上公認的用于醫學臨床及生物學研究的最先進的核酸分子檢測手段，已被世界各國研究機構承認并推崇。

然而，對于乳制品而言，通常成分復雜，其中可能含有多種抑制PCR反應的成分，且乳制品中大腸菌群限量指標較低，如何設計具有較高特異性和靈敏性的引物成為分子生物學技術檢測乳制品中大腸菌群的一個關鍵。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種利用分子生物學技術檢測乳制品中大腸菌群的方法，以縮短乳制品中大腸菌群的檢測時間，提高檢測準確性，且可以定量地檢測乳制品中大腸菌群。

本發明的另一目的在于提供一種用于分子生物學技術檢測乳制品中大腸菌群的特異性引物。

本發明的另一目的在于提供了一種用于分子生物學技術檢測乳制品中大腸菌群的試劑盒，其中包含本發明所述的引物。

為達上述目的，一方面，本發明提供了一種利用分子生物學技術檢測乳制品中大腸菌群的方法，該方法主要包括：

從待測乳制品樣品中提取總DNA；

以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增；所述特異性引物為SEQ?ID?No.1與SEQ?ID?No.2；