[發明專利]一種檢測乳制品中大腸菌群的方法及所用引物

無效

• 申請號: 201410210385.4
• 申請日: 2014-05-19
• 公開（公告）號: CN103981266A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 安穎;齊炳理;陳世賢;張雅君
• 申請（專利權）人: 內蒙古伊利實業集團股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 韓蕾

1.一種檢測乳制品中大腸菌群的方法，該方法主要包括：

從待測乳制品樣品中提取總DNA；

以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增；所述特異性引物為SEQ?ID?No.1與SEQ?ID?No.2；

對上述擴增結果進行分析判斷。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述從待測乳制品樣品提取總DNA的過程包括如下步驟：

將待測乳制品樣品進行増菌培養；

増菌培養后的樣品離心，收集沉淀，加入TE緩沖液重懸，液氮凍融；加入SDS和蛋白酶K，37℃搖床4h以上；

加入CTAB提取緩沖液消化；

用酚仿法抽提；

加入異丙醇沉淀富集DNA。

3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述從待測乳制品樣品提取總DNA的過程包括如下步驟：

按照30～50mL待測乳制品液態樣品：250～350mL營養肉湯的比例，或者30～50g待測乳制品固態樣品：250～350mL營養肉湯的比例進行混合，于37±1℃生化培養箱中増菌培養4～6h；

取増菌培養5h的樣品1mL，12000g，4℃離心10min，收集菌體沉淀；

加入500μL?TE緩沖液，重懸菌體沉淀，液氮凍融4次；

加入80μL10％SDS和10μL20mg/mL蛋白酶K，37℃搖床4h以上；

加入100μL5M?NaCl溶液及80μL10mol/L?CTAB溶液，65℃水浴20min；

用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提，12000g，4℃離心10min，取上清；

用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，取上清；

采用異丙醇沉淀DNA，70％乙醇洗滌，自然干燥，TE溶解備用。

4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述PCR為熒光定量PCR，擴增反應條件如下：

反應體系：10μmol/L上下游引物各0.4μL，DNA模板2μL，Passive?Reference?Dye：0.4μL，2×TransStart?Green?qPCR?SuperMix：10μL，ddH2O補足至20μL；

擴增程序：95℃預變性20s；40個循環，95℃變性5s，62℃退火30s，72℃延伸40s。

5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述乳制品為液態乳制品、奶粉、冷飲。

6.根據權利要求1～5任一項所述的方法，其中，所述乳制品為含乳蛋白的冷凍飲品，其中，增菌培養時按照30mL含乳蛋白的冷凍飲品料液：300mL營養肉湯的比例進行混合，于37℃生化培養箱中増菌培養5h；之后提取DNA進行熒光定量PCR擴增檢測；當低于熒光定量PCR檢測限時，則含乳蛋白的冷凍飲品中大腸菌群數＜450MPN/100mL，符合相關衛生標準。

7.根據權利要求1所述的方法，其中，所述PCR為熒光定量PCR，該方法還包括制作熒光定量PCR標準曲線、并將擴增結果與標準曲線進行比對計算出待測樣品中大腸菌群細菌的活菌數的過程。

8.用于實現權利要求1～7任一項所述檢測乳制品中大腸菌群的方法的引物，該引物如SEQ?ID?No.1與SEQ?ID?No.2所示。

9.一種檢測乳制品中大腸菌群的試劑盒，該試劑盒包含權利要求8所述的引物。

10.根據權利要求9所述的試劑盒，該試劑盒還包括Passive?Reference?Dye以及TransStart?Green?qPCR?SuperMix。