[發明專利]一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉化制備紫堇達明的方法

無效

• 申請號: 201410209741.0
• 申請日: 2014-05-19
• 公開（公告）號: CN103952449A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 劉吉華;索成林;余伯陽
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/545
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種以聚氨酯泡沫固定化灰色鏈霉菌(Streptomyces?griseus)ATCC-13273細胞高效轉化制備紫堇達明的方法。

背景技術

紫堇達明為具有良好鎮痛活性的天然微量活性成分，具有高效快速鎮痛的特點，但其自然來源十分有限，限制了其在醫藥領域的應用。我們先前報道了生物轉化制備左旋紫堇達明的方法(藥物生物技術，2003，10(3)：165-168)，并申請了紫堇達明的生物轉化制備方法及其在制備鎮痛藥中的應用(中國專利ZL02138363.4)和一種高效生產紫堇達明的生物轉化發酵工藝(中國專利ZL201110125328.2)專利，公開了搖瓶和發酵罐非固定化細胞轉化制備紫堇達明的方法。以上方法利用非固定化細胞進行生物堿四氫巴馬汀的轉化，由于生物堿四氫巴馬汀對灰色鏈霉菌細胞的生長具有一定的毒性作用，限制了轉化底物四氫巴馬汀的投料量，且轉化發酵周期較長為96h。為了提高生物轉化生產左旋紫堇達明的產率，縮短發酵周期，我們開發了一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效制備紫堇達明的方法，紫堇達明的轉化產率達59.27％，底物投料濃度及紫堇達明的得率增加1倍，轉化時間縮短至24-48h，一次制備的固定化灰色鏈霉菌細胞可重復使用15-16次，極大提高了轉化制備紫堇達明的效率，減少了發酵廢液排放。固定化灰色鏈霉菌轉化制備紫堇達明工藝操作簡便，生產成本低廉，環境友好，更適宜于工業化轉化制備紫堇達明。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉化制備紫堇達明的方法，利用多孔的聚氨酯泡沫固定灰色鏈霉菌菌絲，菌絲纏繞生長于聚氨酯泡沫的空隙中，使其具有固定效果好，菌絲不易脫落，且操作簡單，固定化細胞可多次重復用于轉化制備紫堇達明且環境優好。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種固定化灰色鏈霉菌細胞高效轉化制備紫堇達明的方法，包括以下工藝步驟：

(1)灰色鏈霉菌(Streptomyces?griseus)ATCC-13273種子液的培養

采用灰色鏈霉菌發酵培養基，滅菌后接種來自于斜面培養的灰色鏈霉菌(Streptomyces?griseus)ATCC-13273，于25-28℃、180rpm搖床培養24-48小時，作為種子液備用；其中，灰色鏈霉菌發酵培養基配方為：3％玉米粉，0.76％豆粕，0.5％酵母粉，0.5％K₂HPO₄，0.12％葡萄糖，0.5％NaCl，0.01％MgSO₄7H₂O，初始pH為6.0-6.5；

(2)聚氨酯泡沫載體的預處理

將聚氨酯泡沫裁剪成邊長為4-10mm的立方體，以5％鹽酸溶液浸泡24h，蒸餾水反復洗滌至中性，然后以5％的氫氧化鈉溶液浸泡24h，蒸餾水反復洗滌至中性，取出后干燥備用；

(3)灰色鏈霉菌細胞的培養與固定化

取250mL三角瓶加入40mL灰色鏈霉菌發酵培養基和0.2-0.6g/L預處理后的聚氨酯泡沫，接入由步驟(1)得到的灰色鏈霉菌種子液，置于180rpm、28℃搖床中培養24-48小時，培養過程中細胞吸附于聚氨酯泡沫空隙內生長，培養及固定化結束后，取出用生理鹽水漂洗3次，得到固定化灰色鏈霉菌，4℃保藏備用；

(4)利用固定化灰色鏈霉菌細胞轉化四氫巴馬汀制備紫堇達明

利用固定化灰色鏈霉菌細胞轉化四氫巴馬汀制備紫堇達明的搖瓶轉化工藝為：取250mL三角瓶加入40mL固定化灰色鏈霉菌細胞轉化培養基、0.2-0.8g/L固定化細胞以及轉化底物四氫巴馬汀，120-180rpm、25-28℃搖床中培養轉化24-48h，轉化發酵液用于紫堇達明的分離制備，固定化細胞按上述相同條件重復用于轉化制備紫堇達明，固定化細胞重復使用15-16次；

利用固定化灰色鏈霉菌細胞轉化四氫巴馬汀制備紫堇達明的發酵罐轉化工藝為：發酵罐中加入灰色鏈霉菌固定化細胞轉化培養基，滅菌后加入0.2-0.8g/L固定化灰色鏈霉菌細胞以及轉化底物四氫巴馬汀，25-28℃、攪拌速度80-160rpm、通氣量1-1.5vvm轉化發酵24-48h，放出發酵液用于紫堇達明的分離制備，發酵罐中再加入滅菌后的轉化培養基和轉化底物相同條件轉化制備紫堇達明，固定化細胞重復使用15-16次；