[發(fā)明專利]一種創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201410209551.9 | 申請(qǐng)日: | 2014-05-16 |
| 公開(公告)號(hào): | CN103981211A | 公開(公告)日: | 2014-08-13 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 倪大虎;楊劍波;魏鵬程;馬卉;李浩;李莉;倪金龍;陸徐忠;宋豐順;楊亞春 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所 |
| 主分類號(hào): | C12N15/82 | 分類號(hào): | C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00 |
| 代理公司: | 北京律譜知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11457 | 代理人: | 黃云鐸 |
| 地址: | 230031 *** | 國省代碼: | 安徽;34 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 一種 創(chuàng)制 授粉 水稻 材料 育種 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于水稻生物技術(shù)育種領(lǐng)域,具體涉及一種快速創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的選育方法。
背景技術(shù)
基因漂移(或基因逃逸,Gene?flow),是指一種生物的目標(biāo)基因向附近野生近緣種自發(fā)轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致附近野生近緣種發(fā)生內(nèi)在變化,具有目標(biāo)基因的一些優(yōu)勢(shì)特征,形成新物種,以致整個(gè)生態(tài)環(huán)境發(fā)生結(jié)構(gòu)性的變化。根據(jù)轉(zhuǎn)基因漂移對(duì)象的不同,可以分為轉(zhuǎn)基因作物的外源基因向其非轉(zhuǎn)基因作物、野生近緣種和同一物種的雜草類型逃逸。基因漂移的途徑主要包括花粉漂移、種子傳播(或擴(kuò)散)和無性繁殖器官的移動(dòng)等。基因漂移一般需要一定的媒介,如風(fēng)、昆蟲、動(dòng)物和水等,其中風(fēng)媒和蟲媒傳粉是最為有效的方式,而花粉也可以產(chǎn)生長距離的漂移
閉花受精(cleistogamy)是在花朵未開放時(shí)成熟花粉粒在花粉囊內(nèi)萌發(fā),花粉管穿出花粉囊,伸向柱頭,進(jìn)入子房,把精子送入胚囊,完成受精。被子植物(60個(gè)科約300種植物)中廣泛存在著閉花受精現(xiàn)象。栽培作物中,大豆、豌豆屬于嚴(yán)格的閉花受精作物,水稻、大麥、棉花、高梁中也存在閉花受精類型。閉花受精能使植物避免外來花粉干擾而保持純種,也可以防止自身花粉向外漂移。因此,閉花受精可作為控制基因漂流的途徑之一。
水稻是典型的開花授精(開穎授粉)的作物。但目前有一些研究分離了部分表現(xiàn)為閉穎性狀的水稻突變體,如:單個(gè)隱性基因d7決定CL突變體的表型(不正常的護(hù)穎,使外穎和內(nèi)穎結(jié)合在一起);單個(gè)隱性基因ld(t)[lodiculeless?spikelet(t)]突變產(chǎn)生漿片缺失突變體,穎殼不張開;水稻直立穗基因DEP2突變能產(chǎn)生嚴(yán)格的閉穎授粉性狀。
雖然閉穎材料品種在水稻轉(zhuǎn)基因育種方面具有廣闊的應(yīng)用前景,但是天然的遺傳突變資源有限,應(yīng)用存在一定的技術(shù)難度。通過傳統(tǒng)的回交導(dǎo)入技術(shù),育種周期漫長,成本較大,且可能導(dǎo)入與突變位點(diǎn)連鎖的其他供體基因組片段,對(duì)品種選育帶來不可預(yù)知的風(fēng)險(xiǎn)。因此,人們希望獲得一種能夠快速定向創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的方法。
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問題,本發(fā)明提供了一種創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:
步驟1,在水稻閉穎授粉決定基因DEP2的第一、第二或第三外顯子區(qū)選取靶標(biāo)片段;
其中,所述靶標(biāo)片段的雙鏈結(jié)構(gòu)中的一條鏈具有NGG結(jié)構(gòu),其中N代表堿基A、T、G、C中的任意一種;
步驟2,按照靶標(biāo)序列的核苷酸排列順序,構(gòu)建用于水稻DEP2基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體,所述重組載體包含向?qū)NA表達(dá)框和Cas9核酸酶表達(dá)框,所述向?qū)NA表達(dá)框包含所述靶標(biāo)片段;
步驟3,將所述重組載體導(dǎo)入水稻細(xì)胞,使所述向?qū)NA表達(dá)框和所述Cas9核酸酶表達(dá)框在水稻細(xì)胞中共同表達(dá),剪切DEP2基因的雙鏈的所述靶標(biāo)片段,誘發(fā)所述水稻細(xì)胞自身的DNA修復(fù)功能,在靶標(biāo)位點(diǎn)隨機(jī)插入或缺失堿基,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)DEP2基因的功能缺失突變;
步驟4,用導(dǎo)入所述重組載體的水稻細(xì)胞再生植株;
步驟5,對(duì)所述再生植株中DEP2基因包含靶標(biāo)片段的DNA區(qū)段進(jìn)行測序;
步驟6,選擇兩個(gè)等位DEP2基因都出現(xiàn)功能缺失突變的再生植株,進(jìn)行表型鑒定,觀察所述再生植株的開花習(xí)性,挑取完全閉穎授粉的植株,作為所創(chuàng)制的閉穎授粉水稻材料。
優(yōu)選地,所述靶標(biāo)片段的雙鏈結(jié)構(gòu)中的一條鏈具有5’-(N)X-NGG-3’結(jié)構(gòu),其中,(N)X表示數(shù)目為X的一條堿基序列{N1,N2……Nx},N1,N2……Nx中的每一個(gè)表示A、G、C、T中的任意一個(gè),NGG中的N也代表A、G、C、T中的任意一個(gè)。X一般為19或20。
優(yōu)選地,所述重組載體包含向?qū)NA表達(dá)框,其能夠在水稻細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并且核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示,并且所述重組載體包含Cas9核酸酶表達(dá)框,其能夠在水稻細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并且核苷酸序列如Seq?ID?No.2所示。也可以說,另一方面本發(fā)明還提供了這種重組載體。
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