[發明專利]一種創制閉穎授粉水稻材料的育種方法

有效

• 申請號: 201410209551.9
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN103981211A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 倪大虎;楊劍波;魏鵬程;馬卉;李浩;李莉;倪金龍;陸徐忠;宋豐順;楊亞春
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

技術領域

本發明屬于水稻生物技術育種領域，具體涉及一種快速創制閉穎授粉水稻材料的選育方法。

背景技術

基因漂移(或基因逃逸，Gene?flow)，是指一種生物的目標基因向附近野生近緣種自發轉移，導致附近野生近緣種發生內在變化，具有目標基因的一些優勢特征，形成新物種，以致整個生態環境發生結構性的變化。根據轉基因漂移對象的不同，可以分為轉基因作物的外源基因向其非轉基因作物、野生近緣種和同一物種的雜草類型逃逸。基因漂移的途徑主要包括花粉漂移、種子傳播(或擴散)和無性繁殖器官的移動等。基因漂移一般需要一定的媒介，如風、昆蟲、動物和水等，其中風媒和蟲媒傳粉是最為有效的方式，而花粉也可以產生長距離的漂移

閉花受精(cleistogamy)是在花朵未開放時成熟花粉粒在花粉囊內萌發，花粉管穿出花粉囊，伸向柱頭,進入子房，把精子送入胚囊,完成受精。被子植物(60個科約300種植物)中廣泛存在著閉花受精現象。栽培作物中，大豆、豌豆屬于嚴格的閉花受精作物，水稻、大麥、棉花、高梁中也存在閉花受精類型。閉花受精能使植物避免外來花粉干擾而保持純種，也可以防止自身花粉向外漂移。因此，閉花受精可作為控制基因漂流的途徑之一。

水稻是典型的開花授精(開穎授粉)的作物。但目前有一些研究分離了部分表現為閉穎性狀的水稻突變體，如：單個隱性基因d7決定CL突變體的表型(不正常的護穎,使外穎和內穎結合在一起)；單個隱性基因ld(t)[lodiculeless?spikelet(t)]突變產生漿片缺失突變體，穎殼不張開；水稻直立穗基因DEP2突變能產生嚴格的閉穎授粉性狀。

雖然閉穎材料品種在水稻轉基因育種方面具有廣闊的應用前景，但是天然的遺傳突變資源有限，應用存在一定的技術難度。通過傳統的回交導入技術，育種周期漫長，成本較大，且可能導入與突變位點連鎖的其他供體基因組片段，對品種選育帶來不可預知的風險。因此，人們希望獲得一種能夠快速定向創制閉穎授粉水稻材料的方法。

發明內容

針對上述問題，本發明提供了一種創制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟1，在水稻閉穎授粉決定基因DEP2的第一、第二或第三外顯子區選取靶標片段；

其中，所述靶標片段的雙鏈結構中的一條鏈具有NGG結構，其中N代表堿基A、T、G、C中的任意一種；

步驟2，按照靶標序列的核苷酸排列順序，構建用于水稻DEP2基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體，所述重組載體包含向導RNA表達框和Cas9核酸酶表達框，所述向導RNA表達框包含所述靶標片段；

步驟3，將所述重組載體導入水稻細胞，使所述向導RNA表達框和所述Cas9核酸酶表達框在水稻細胞中共同表達，剪切DEP2基因的雙鏈的所述靶標片段，誘發所述水稻細胞自身的DNA修復功能，在靶標位點隨機插入或缺失堿基，實現細胞內DEP2基因的功能缺失突變；

步驟4，用導入所述重組載體的水稻細胞再生植株；

步驟5，對所述再生植株中DEP2基因包含靶標片段的DNA區段進行測序；

步驟6，選擇兩個等位DEP2基因都出現功能缺失突變的再生植株，進行表型鑒定，觀察所述再生植株的開花習性，挑取完全閉穎授粉的植株，作為所創制的閉穎授粉水稻材料。

優選地，所述靶標片段的雙鏈結構中的一條鏈具有5’-(N)_X-NGG-3’結構，其中，(N)_X表示數目為X的一條堿基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一個表示A、G、C、T中的任意一個，NGG中的N也代表A、G、C、T中的任意一個。X一般為19或20。

優選地，所述重組載體包含向導RNA表達框，其能夠在水稻細胞內表達并且核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示，并且所述重組載體包含Cas9核酸酶表達框，其能夠在水稻細胞內表達并且核苷酸序列如Seq?ID?No.2所示。也可以說，另一方面本發明還提供了這種重組載體。