[發(fā)明專利]一種創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410209551.9
• 申請(qǐng)日: 2014-05-16
• 公開（公告）號(hào): CN103981211A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 倪大虎;楊劍波;魏鵬程;馬卉;李浩;李莉;倪金龍;陸徐忠;宋豐順;楊亞春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京律譜知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于水稻生物技術(shù)育種領(lǐng)域，具體涉及一種快速創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的選育方法。

背景技術(shù)

基因漂移(或基因逃逸，Gene?flow)，是指一種生物的目標(biāo)基因向附近野生近緣種自發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致附近野生近緣種發(fā)生內(nèi)在變化，具有目標(biāo)基因的一些優(yōu)勢(shì)特征，形成新物種，以致整個(gè)生態(tài)環(huán)境發(fā)生結(jié)構(gòu)性的變化。根據(jù)轉(zhuǎn)基因漂移對(duì)象的不同，可以分為轉(zhuǎn)基因作物的外源基因向其非轉(zhuǎn)基因作物、野生近緣種和同一物種的雜草類型逃逸。基因漂移的途徑主要包括花粉漂移、種子傳播(或擴(kuò)散)和無性繁殖器官的移動(dòng)等。基因漂移一般需要一定的媒介，如風(fēng)、昆蟲、動(dòng)物和水等，其中風(fēng)媒和蟲媒傳粉是最為有效的方式，而花粉也可以產(chǎn)生長距離的漂移

閉花受精(cleistogamy)是在花朵未開放時(shí)成熟花粉粒在花粉囊內(nèi)萌發(fā)，花粉管穿出花粉囊，伸向柱頭,進(jìn)入子房，把精子送入胚囊,完成受精。被子植物(60個(gè)科約300種植物)中廣泛存在著閉花受精現(xiàn)象。栽培作物中，大豆、豌豆屬于嚴(yán)格的閉花受精作物，水稻、大麥、棉花、高梁中也存在閉花受精類型。閉花受精能使植物避免外來花粉干擾而保持純種，也可以防止自身花粉向外漂移。因此，閉花受精可作為控制基因漂流的途徑之一。

水稻是典型的開花授精(開穎授粉)的作物。但目前有一些研究分離了部分表現(xiàn)為閉穎性狀的水稻突變體，如：單個(gè)隱性基因d7決定CL突變體的表型(不正常的護(hù)穎,使外穎和內(nèi)穎結(jié)合在一起)；單個(gè)隱性基因ld(t)[lodiculeless?spikelet(t)]突變產(chǎn)生漿片缺失突變體，穎殼不張開；水稻直立穗基因DEP2突變能產(chǎn)生嚴(yán)格的閉穎授粉性狀。

雖然閉穎材料品種在水稻轉(zhuǎn)基因育種方面具有廣闊的應(yīng)用前景，但是天然的遺傳突變資源有限，應(yīng)用存在一定的技術(shù)難度。通過傳統(tǒng)的回交導(dǎo)入技術(shù)，育種周期漫長，成本較大，且可能導(dǎo)入與突變位點(diǎn)連鎖的其他供體基因組片段，對(duì)品種選育帶來不可預(yù)知的風(fēng)險(xiǎn)。因此，人們希望獲得一種能夠快速定向創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供了一種創(chuàng)制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟1，在水稻閉穎授粉決定基因DEP2的第一、第二或第三外顯子區(qū)選取靶標(biāo)片段；

其中，所述靶標(biāo)片段的雙鏈結(jié)構(gòu)中的一條鏈具有NGG結(jié)構(gòu)，其中N代表堿基A、T、G、C中的任意一種；

步驟2，按照靶標(biāo)序列的核苷酸排列順序，構(gòu)建用于水稻DEP2基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體，所述重組載體包含向?qū)NA表達(dá)框和Cas9核酸酶表達(dá)框，所述向?qū)NA表達(dá)框包含所述靶標(biāo)片段；

步驟3，將所述重組載體導(dǎo)入水稻細(xì)胞，使所述向?qū)NA表達(dá)框和所述Cas9核酸酶表達(dá)框在水稻細(xì)胞中共同表達(dá)，剪切DEP2基因的雙鏈的所述靶標(biāo)片段，誘發(fā)所述水稻細(xì)胞自身的DNA修復(fù)功能，在靶標(biāo)位點(diǎn)隨機(jī)插入或缺失堿基，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)DEP2基因的功能缺失突變；

步驟4，用導(dǎo)入所述重組載體的水稻細(xì)胞再生植株；

步驟5，對(duì)所述再生植株中DEP2基因包含靶標(biāo)片段的DNA區(qū)段進(jìn)行測序；

步驟6，選擇兩個(gè)等位DEP2基因都出現(xiàn)功能缺失突變的再生植株，進(jìn)行表型鑒定，觀察所述再生植株的開花習(xí)性，挑取完全閉穎授粉的植株，作為所創(chuàng)制的閉穎授粉水稻材料。

優(yōu)選地，所述靶標(biāo)片段的雙鏈結(jié)構(gòu)中的一條鏈具有5’-(N)_X-NGG-3’結(jié)構(gòu)，其中，(N)_X表示數(shù)目為X的一條堿基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一個(gè)表示A、G、C、T中的任意一個(gè)，NGG中的N也代表A、G、C、T中的任意一個(gè)。X一般為19或20。

優(yōu)選地，所述重組載體包含向?qū)NA表達(dá)框，其能夠在水稻細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并且核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示，并且所述重組載體包含Cas9核酸酶表達(dá)框，其能夠在水稻細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并且核苷酸序列如Seq?ID?No.2所示。也可以說，另一方面本發(fā)明還提供了這種重組載體。