[發明專利]一種創制閉穎授粉水稻材料的育種方法有效
| 申請號: | 201410209551.9 | 申請日: | 2014-05-16 |
| 公開(公告)號: | CN103981211A | 公開(公告)日: | 2014-08-13 |
| 發明(設計)人: | 倪大虎;楊劍波;魏鵬程;馬卉;李浩;李莉;倪金龍;陸徐忠;宋豐順;楊亞春 | 申請(專利權)人: | 安徽省農業科學院水稻研究所 |
| 主分類號: | C12N15/82 | 分類號: | C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 創制 授粉 水稻 材料 育種 方法 | ||
技術領域
本發明屬于水稻生物技術育種領域,具體涉及一種快速創制閉穎授粉水稻材料的選育方法。
背景技術
基因漂移(或基因逃逸,Gene?flow),是指一種生物的目標基因向附近野生近緣種自發轉移,導致附近野生近緣種發生內在變化,具有目標基因的一些優勢特征,形成新物種,以致整個生態環境發生結構性的變化。根據轉基因漂移對象的不同,可以分為轉基因作物的外源基因向其非轉基因作物、野生近緣種和同一物種的雜草類型逃逸。基因漂移的途徑主要包括花粉漂移、種子傳播(或擴散)和無性繁殖器官的移動等。基因漂移一般需要一定的媒介,如風、昆蟲、動物和水等,其中風媒和蟲媒傳粉是最為有效的方式,而花粉也可以產生長距離的漂移
閉花受精(cleistogamy)是在花朵未開放時成熟花粉粒在花粉囊內萌發,花粉管穿出花粉囊,伸向柱頭,進入子房,把精子送入胚囊,完成受精。被子植物(60個科約300種植物)中廣泛存在著閉花受精現象。栽培作物中,大豆、豌豆屬于嚴格的閉花受精作物,水稻、大麥、棉花、高梁中也存在閉花受精類型。閉花受精能使植物避免外來花粉干擾而保持純種,也可以防止自身花粉向外漂移。因此,閉花受精可作為控制基因漂流的途徑之一。
水稻是典型的開花授精(開穎授粉)的作物。但目前有一些研究分離了部分表現為閉穎性狀的水稻突變體,如:單個隱性基因d7決定CL突變體的表型(不正常的護穎,使外穎和內穎結合在一起);單個隱性基因ld(t)[lodiculeless?spikelet(t)]突變產生漿片缺失突變體,穎殼不張開;水稻直立穗基因DEP2突變能產生嚴格的閉穎授粉性狀。
雖然閉穎材料品種在水稻轉基因育種方面具有廣闊的應用前景,但是天然的遺傳突變資源有限,應用存在一定的技術難度。通過傳統的回交導入技術,育種周期漫長,成本較大,且可能導入與突變位點連鎖的其他供體基因組片段,對品種選育帶來不可預知的風險。因此,人們希望獲得一種能夠快速定向創制閉穎授粉水稻材料的方法。
發明內容
針對上述問題,本發明提供了一種創制閉穎授粉水稻材料的育種方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:
步驟1,在水稻閉穎授粉決定基因DEP2的第一、第二或第三外顯子區選取靶標片段;
其中,所述靶標片段的雙鏈結構中的一條鏈具有NGG結構,其中N代表堿基A、T、G、C中的任意一種;
步驟2,按照靶標序列的核苷酸排列順序,構建用于水稻DEP2基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體,所述重組載體包含向導RNA表達框和Cas9核酸酶表達框,所述向導RNA表達框包含所述靶標片段;
步驟3,將所述重組載體導入水稻細胞,使所述向導RNA表達框和所述Cas9核酸酶表達框在水稻細胞中共同表達,剪切DEP2基因的雙鏈的所述靶標片段,誘發所述水稻細胞自身的DNA修復功能,在靶標位點隨機插入或缺失堿基,實現細胞內DEP2基因的功能缺失突變;
步驟4,用導入所述重組載體的水稻細胞再生植株;
步驟5,對所述再生植株中DEP2基因包含靶標片段的DNA區段進行測序;
步驟6,選擇兩個等位DEP2基因都出現功能缺失突變的再生植株,進行表型鑒定,觀察所述再生植株的開花習性,挑取完全閉穎授粉的植株,作為所創制的閉穎授粉水稻材料。
優選地,所述靶標片段的雙鏈結構中的一條鏈具有5’-(N)X-NGG-3’結構,其中,(N)X表示數目為X的一條堿基序列{N1,N2……Nx},N1,N2……Nx中的每一個表示A、G、C、T中的任意一個,NGG中的N也代表A、G、C、T中的任意一個。X一般為19或20。
優選地,所述重組載體包含向導RNA表達框,其能夠在水稻細胞內表達并且核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示,并且所述重組載體包含Cas9核酸酶表達框,其能夠在水稻細胞內表達并且核苷酸序列如Seq?ID?No.2所示。也可以說,另一方面本發明還提供了這種重組載體。
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