[發明專利]一種創制閉穎授粉水稻材料的育種方法

有效

• 申請號: 201410209551.9
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN103981211A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 倪大虎;楊劍波;魏鵬程;馬卉;李浩;李莉;倪金龍;陸徐忠;宋豐順;楊亞春
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

1.一種創制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟1，在水稻閉穎授粉決定基因DEP2外顯子區選取靶標片段；

其中，所述靶標片段的雙鏈結構中的一條鏈具有NGG結構，其中N代表堿基A、T、G、C中的任意一種；

步驟2，按照靶標序列的核苷酸排列順序，構建用于水稻DEP2基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體，所述重組載體包含向導RNA表達框和Cas9核酸酶表達框，所述向導RNA表達框包含所述靶標片段；

步驟3，將所述重組載體導入水稻細胞，使所述向導RNA表達框和所述Cas9核酸酶表達框在水稻細胞中共同表達，剪切DEP2基因的雙鏈的所述靶標片段，誘發所述水稻細胞自身的DNA修復功能，在靶標位點隨機插入或缺失堿基，實現細胞內DEP2基因的功能缺失突變；

步驟4，用導入所述重組載體的水稻細胞再生植株；

步驟5，對所述再生植株中DEP2基因包含靶標片段的DNA區段進行測序；

步驟6，選擇兩個等位DEP2基因都出現功能缺失突變的再生植株，進行表型鑒定，觀察所述再生植株的開花習性，挑取完全閉穎授粉的植株，作為所創制的閉穎授粉水稻材料。

2.根據權利要求1所述的創制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，所述靶標片段的雙鏈結構中的一條鏈具有5’-(N)_X-NGG-3’結構，其中，(N)_X表示數目為X的一條堿基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一個表示A、G、C、T中的任意一個。

3.根據權利要求2所述的創制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，所述向導RNA表達框能夠在水稻細胞內表達并且核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示；所述Cas9核酸酶表達框能夠在水稻細胞內表達并且核苷酸序列如Seq?ID?No.2所示。

4.根據權利要求2所述的創制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，所述向導RNA表達框包括：水稻U6啟動子，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1第1至246位所示；結構特征為(N)_X的靶標序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1第266至349位所示；和Poly-T終止子，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1第350至357位所示，

所述Cas9核酸酶表達框包括：玉米ZmUBI啟動子，其核苷酸序列如Seq?ID?No.2第1至2031位所示；植物偏好密碼子改造后的Cas9編碼序列，其核苷酸序列如Seq?ID?No.2第2034至6305位所示；以及tNOS終止子，其核苷酸序列如Seq?ID?No.2第6347至6599位所示。

5.根據權利要求3所述的創制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，

所述向導RNA表達框包括CRISPR?RNA序列，其具有所述靶標片段的5’-(N)_X-NGG-3’中的(N)_X或與之互補的序列。

6.根據權利要求3所述的創制閉穎授粉水稻材料的育種方法，其特征在于，所述靶標片段位于水稻閉穎授粉決定基因DEP2的第一、第二和/或第三外顯子上。