[發明專利]判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法

無效

• 申請號: 201410208521.6
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN103983786A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 陳學新;任少鵬;時敏;楊帆
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

技術領域

本發明屬于涉及生物研究的基礎領域，具體涉及一種判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法。

背景技術

隨著DNA重組技術的不斷發展，利用基因工程技術培育的抗蟲品種已經在世界范圍內廣泛種植，這些品種表達來自蘇云金桿菌(Bt)的Cry毒素，現已成為害蟲防治的一種有效手段。然而，轉基因作物的生態風險特別是對環境和非靶標有機體的影響一直是人們關注的焦點。轉基因抗蟲作物對非靶標生物的影響主要是指對農田生態系統中非靶標的害蟲、有益生物以及對作物不產生危害的昆蟲類等的影響。由于不同類型的Bt殺蟲蛋白具有不同的殺蟲譜，因此轉基因植物中不同的Bt基因表達必然會對非靶標昆蟲產生直接或者間接的影響，這種影響與昆蟲對Bt殺蟲蛋白的敏感程度以及轉基因植株中Bt殺蟲蛋白的表達濃度有關。轉基因作物會通過食物鏈和食物網影響更高營養級昆蟲的生長發育及繁殖，影響以植食類昆蟲為食的捕食或者寄生性天敵，進而影響整個營養層級的節肢動物種類組成和種群動態，引起農田群落結構的變化。

刺吸式害蟲，特別是蚜蟲是大多數農田中廣泛存在的一種食草動物，由于其是許多常見的捕食性和寄生性天敵昆蟲(比如草蛉、食蚜蠅和瓢蟲等)的主要甚至是專一的食物，因此蚜蟲經常被作為指示性生物來用于轉基因作物的環境風險評價。根據蚜蟲專性取食植物韌皮部汁液的特性，在轉基因作物的韌皮部汁液中是否存在殺蟲蛋白便成為殺蟲蛋白能否通過食物鏈和食物網影響更高營養級昆蟲的關鍵。

目前，國內外的研究中，常用的提取植物汁液的方法有兩種，一種是使用微型毛血管，另一種是使用乙二胺四乙酸緩沖液直接從割破的葉片傷口處提取汁液。但是，第二種方法被證實在葉片被割破后，來自破損細胞的汁液會污染樣品從而導致結果的不準確性，第一種方法雖然能避免污染的發生，但是操作過程比較繁瑣，而且對技術的熟練度也要求較高。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法。

為解決技術問題，本發明的解決方案是：

提供一種判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法，具體包括如下步驟：

(1)將經過浸種、催芽處理的轉基因水稻種子平鋪到塑料托盤中，加入清水使其沒過上述水稻種子，然后將塑料托盤放置于人工氣候箱；所述放置條件是：溫度28℃、濕度75％、先光照14小時(6:00-20:00)、后黑暗10小時(20:00-6:00)，且光照照度為22000LX，當水位低于水稻根系位置時從塑料托盤邊緣加入清水進行補充，以保證水位沒過水稻根系；待到水稻芽變綠，加入以沒過水稻根系用量的營養液；

(2)當步驟(1)中的水稻種子出苗5天后，每天早晨使用移液槍收集水稻苗葉尖部吐出的水珠，然后存放于離心管中，每份樣品標記好時間、樣品名稱，并放置于-20℃冰箱內儲存，所述每個水稻品系至少收集3毫升的樣品；

(3)待樣品收集完畢，將同一水稻品系每天收集到的樣品混合在一起，振蕩均勻，然后每個水稻品系設定三個重復，每個重復取1毫升樣品加入500微升PBS/0.55％Tween-20并且振蕩均勻；

(4)將Bt(Cry1Ab)純蛋白用所述PBS/0.55％Tween-20分別稀釋到0.2ppb、0.4ppb、0.8ppb、1.6ppb、3.2ppb和6.4ppb的濃度用作標準曲線的取樣點；

(5)根據蛋白酶聯免疫檢測(ELISA)試劑盒的說明書的要求，先加50微升Cry1Ab酶結合物到酶標板的每個孔中，緊接著快速加入50微升的PBS/0.55％Tween-20到第一個孔作為空白對照，加入50微升的Cry1Ab陽性對照到第二個孔，根據待測樣品數量在酶標板剩下的孔中依次加入50微升的樣品；

(6)將酶標板放在桌面上小心的以畫圈的方式搖勻20～30秒鐘，然后放入搖床以200rpm、室溫條件放置90分鐘；

(7)取出上述酶標板，迅速將其翻轉把孔里的液體倒進水槽中，然后加入PBS/0.05％Tween-20，再將其翻轉清空，隨后在毛巾或紙巾上拍打酶標板，以確保液體清除干凈，重復此過程三次；

(8)然后在所述酶標板的每個孔中加入100微升基質；

(9)同步驟(6)在搖床中放置30分鐘；

(10)在所述酶標板的每個孔中加入100微升終止液，然后搖勻；

(11)將酶標板放入MQX200酶標儀中以450nm條件讀板，記錄數據；