[發明專利]判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法

無效

• 申請號: 201410208521.6
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN103983786A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 陳學新;任少鵬;時敏;楊帆
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

1.一種判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

(1)將經過浸種、催芽處理的轉基因水稻種子平鋪到塑料托盤中，加入清水使其沒過上述水稻種子，然后將塑料托盤放置于人工氣候箱；所述放置條件是：溫度28℃、濕度75％、先光照14小時后黑暗10小時，且所述光照的照度為22000LX，當水位低于水稻根系位置時從塑料托盤邊緣加入清水進行補充，以保證水位沒過水稻根系；待到水稻芽變綠，加入以沒過水稻根系用量的營養液；

(2)當步驟(1)中的水稻種子出苗5天后，每天早晨使用移液槍收集水稻苗葉尖部吐出的水珠，然后存放于離心管中，每份樣品標記好時間、樣品名稱，并放置于-20℃冰箱內儲存，所述每個水稻品系至少收集3毫升的樣品；

(3)待樣品收集完畢，將同一水稻品系每天收集到的樣品混合在一起，振蕩均勻，然后每個水稻品系設定三個重復，每個重復取1毫升樣品加入500微升PBS/0.55％Tween-20并且振蕩均勻；

(4)將Bt純蛋白用PBS/0.55％Tween-20分別稀釋到0.2ppb、0.4ppb、0.8ppb、1.6ppb、3.2ppb和6.4ppb的濃度用作標準曲線的取樣點；

(5)然后先加50微升Cry1Ab酶結合物到酶標板的每個孔中，接著加入50微升的PBS/0.55％Tween-20到第一個孔作為空白對照，加入50微升的Cry1Ab陽性對照到第二個孔，根據待測樣品數量在酶標板剩下的孔中依次加入50微升的樣品；

(6)將酶標板放在桌面上并以畫圈的方式搖勻20～30秒鐘，然后放入搖床以200rpm、室溫條件放置90分鐘；

(7)取出上述酶標板，將其翻轉把孔里的液體倒進水槽中，然后加入PBS/0.05％Tween-20，再將其翻轉清空，隨后在毛巾或紙巾上拍打酶標板，以確保液體清除干凈，重復此過程三次；

(8)然后在所述酶標板的每個孔中加入100微升基質；

(9)接著同步驟(6)在搖床中放置30分鐘；

(10)所述酶標板的每個孔中加入100微升終止液，然后搖勻；

(11)將所述酶標板放入MQX200酶標儀中以450nm條件讀板，記錄數據；

(12)根據步驟(4)所稀釋的不同濃度的樣品的讀板數據制作標準曲線，然后將水稻樣品的讀板數據帶入標準曲線方程，從而得到水稻樣品中Bt殺蟲蛋白的含量。

2.根據權利要求1所述的判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法，其特征在于，所述步驟(2)中選用水稻苗葉尖部吐出的水珠為韌皮部汁液的替代品。

3.根據權利要求1所述的判斷轉基因水稻韌皮部汁液中是否含有Bt殺蟲蛋白方法，其特征在于，所述營養液的配方如下：

①將91.6g?NH₄NO₃和88.6g?CaCl₂溶解于1L蒸餾水中作為儲備液1；②將40.3gNaH₂PO₄·2H₂O和71.4g?K₂SO₄溶解于1L蒸餾水中作為儲備液2；③將324gMgSO₄·7H₂O溶解于1L蒸餾水中作為儲備液3；④將1.5g?MnCl₂·4H₂O、0.934g?H₃BO₃、0.031g?CuSO₄·5H₂O、0.074g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.035g?ZnSO₄·7H₂O、7.7gFeCl₃·6H₂O和11.9g檸檬酸一水合物溶解在800ml蒸餾水中，然后加入50ml濃硫酸，再加蒸餾水至1L作為微量元素儲備液；⑤取儲備液1、儲備液2、儲備液3各5ml和微量元素儲備液4ml混合，并加蒸餾水至4L，然后用1NNaOH調PH，使PH值為4.5-5.0。