[發明專利]一種利用宿主肝臟線粒體基因突變檢測家畜內毒素中毒的方法

無效

• 申請號: 201410208494.2
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN103993080A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 高洪;嚴玉霖;彭輅;周銘濤;陳利平;陳玲;趙汝
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 昆明祥和知識產權代理有限公司 53114
• 代理人: 唐德林

技術領域

本發明涉及家畜內毒素中毒的檢測方法，具體涉及利用宿主肝臟線粒體COI基因點突變來檢測家畜內毒素中毒的方法。

背景技術

規模化飼養家畜過程中細菌感染和濫用抗生素容易導致家畜發生內毒素中毒，內毒素中毒檢測是診斷家畜疾病的重要手段。傳統方法是分離制備毒素，給小白鼠灌胃，通過臨床癥狀進行判斷，或者是采集血液，用昂貴的鱟試驗法進行診斷。以上兩種方法費時費力，檢測成本高，檢測結果對于不同種類家畜不準確。

發明內容

本發明的目的在于提供一種準確，快速，簡便，檢測成本低，易于推廣應用的利用宿主肝臟線粒體基因突變檢測家畜內毒素中毒的方法。

本發明公開了一種利用宿主肝臟線粒體基因突變檢測家畜內毒素中毒的方法，包括肝臟mtDNA提取、mtDNA?COI基因片段的擴增、PCR產物的SSCP分析和DNA序列測定步驟，其特征在于選擇了肝臟線粒體基因中的細胞色素C氧化酶(COI)基因，設計了特異性引物，可以擴增該基因的5308-5611位置上的基因片段。

在上述的檢測方法中，所述的mtDNA提取步驟中試劑配方如下：

(1)?SE溶液(pH:?7.8)：0.25M蔗糖、2.5mM?CaCl2、30mM?Tris-HCl、10mM?EDTANa2；

(2)?溶液Ⅰ(TEN，pH8.0)：0.15M?NaCl、10mM?EDTANa2、10mM?Tris-HCl；

(3)?溶液Ⅱ：1%SDS，其中含0.2N?NaOH，現用現配，混勻，立即使用；

(4)?溶液Ⅲ：3M?Kac，其中含3M?KAc、5M?冰乙酸，混勻，高壓滅菌，室溫保存備用;

(5)?TE溶液(pH:?8.0)：10mM?Tris-HCl、0.1mM?EDTANa2、20ug/ml?DNase-free?RNase。

所述的肝臟mtDNA提取步驟如下：

(1)?取樣品的肝組織0.5g～1.0g，在冰預冷的SE溶液中洗去血污后轉入6ml冰預冷SE中剪碎，再轉入10ml離心管中，高速分散器上1500rpm勻漿3次，每次間隔20sec，每次勻漿10sec，然后離心機上2000rpm離心15min，棄沉淀，上清轉入1.5ml?Eppendorf管中；

(2)?Eppendorf管中的上清液12000rpm離心15min，棄上清，每管加1ml?0℃預冷的SE溶液重懸沉淀，混勻后轉入第二支的eppendorf管，12000rpm離心8min，棄上清，每管加150μl溶液Ⅰ，輕輕充分混勻，室溫靜置15min，每管加300μl新配制的溶液Ⅱ，小心混勻，0℃冰箱中冰浴10min后，每管加4℃預冷的225μl溶液Ⅲ，小心混勻，于0℃冰箱中冰浴30min后，12000rpm離心6min，棄沉淀，小心取上清（注意不要吸取白色物質以免造成污染）轉入第三支的Eppendorf管；

(3)?加入水飽和酚于第三支Eppendorf管的上清液中，混勻，上下顛倒輕輕搖動20min后，再加入氯仿-異戊醇，上下顛倒輕搖15min混勻后，12000rpm離心8min，取水相轉入第四支的Eppendorf管，重復步驟(2)一至三次至液體中間層無白色物質為止；

(4)?取經過步驟（3）處理后的水相于Eppendorf管中，加入2倍體積于水相的無水乙醇，混勻，于0℃冰箱內冰浴30min，12000rpm離心10min，棄上清，用0℃預冷的70%乙醇洗滌沉淀2-3次，每次洗滌后，12000rpm離心5min，徹底去上清，所得沉淀即為純化的mtDNA；

(5)?純化的mtDNA于空氣中自然干燥90-120min（或真空干燥），然后每管加50μl?TE溶液，于室溫下充分溶解60-90min，轉入4℃冰箱中過夜，第二天于恒溫水浴箱中68℃水浴30min或100℃水浴10min以滅活DNase和RNase，分裝后于4℃保存備用或-20℃長期保存。

所述的mtDNA?COI基因片段的擴增步驟如下：

特異性引物序列如下：

表1???COI基因片段的PCR引物序列??

Table?1???PCR?primer?sequncee?of?every?target?gene?fragmen

目標基因片段PCR反應體系組成及循環參數見下表（表2）。

表2???COI基因片段?50μl?PCR反應體系的組成