[發明專利]一種利用宿主肝臟線粒體基因突變檢測家畜內毒素中毒的方法

無效

• 申請號: 201410208494.2
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN103993080A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 高洪;嚴玉霖;彭輅;周銘濤;陳利平;陳玲;趙汝
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 昆明祥和知識產權代理有限公司 53114
• 代理人: 唐德林

1.一種利用宿主肝臟線粒體基因突變檢測家畜內毒素中毒的方法，包括肝臟mtDNA提取、mtDNA?COI基因片段的擴增、PCR產物的SSCP分析和DNA序列測定步驟，其特征在于選擇了肝臟線粒體基因中的細胞色素C氧化酶(COI)基因，設計了特異性引物，可以擴增該基因的5308-5611位置上的基因片段，結合SSCP技術檢測該基因片段的突變來確定家畜內毒素是否中毒。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的mtDNA提取步驟中試劑配方如下：

(1)?SE溶液(pH:?7.8)：0.25M蔗糖、2.5mM?CaCl2、30mM?Tris-HCl、10mM?EDTANa2；

(2)?溶液Ⅰ(TEN，pH8.0)：0.15M?NaCl、10mM?EDTANa2、10mM?Tris-HCl；

(3)?溶液Ⅱ：1%SDS，其中含0.2N?NaOH，現用現配，混勻，立即使用；

(4)?溶液Ⅲ：3M?Kac，其中含3M?KAc、5M?冰乙酸，混勻，高壓滅菌，室溫保存備用;

(5)?TE溶液(pH:?8.0)：10mM?Tris-HCl、0.1mM?EDTANa2、20ug/ml?DNase-free?RNase。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的肝臟mtDNA提取步驟如下：

(1)?取樣品的肝組織0.5g～1.0g，在冰預冷的SE溶液中洗去血污后轉入6ml冰預冷SE中剪碎，再轉入10ml離心管中，高速分散器上1500rpm勻漿3次，每次間隔20sec，每次勻漿10sec，然后離心機上2000rpm離心15min，棄沉淀，上清轉入1.5ml?Eppendorf管中；

(2)?Eppendorf管中的上清液12000rpm離心15min，棄上清，每管加1ml?0℃預冷的SE溶液重懸沉淀，混勻后轉入第二支的eppendorf管，12000rpm離心8min，棄上清，每管加150μl溶液Ⅰ，輕輕充分混勻，室溫靜置15min，每管加300μl新配制的溶液Ⅱ，小心混勻，0℃冰箱中冰浴10min后，每管加4℃預冷的225μl溶液Ⅲ，小心混勻，于0℃冰箱中冰浴30min后，12000rpm離心6min，棄沉淀，小心取上清（注意不要吸取白色物質以免造成污染）轉入第三支的Eppendorf管；?

(3)?加入水飽和酚于第三支Eppendorf管的上清液中，混勻，上下顛倒輕輕搖動20min后，再加入氯仿-異戊醇，上下顛倒輕搖15min混勻后，12000rpm離心8min，取水相轉入第四支的Eppendorf管，重復步驟(2)一至三次至液體中間層無白色物質為止；

(4)?取經過步驟（3）處理后的水相于Eppendorf管中，加入2倍體積于水相的無水乙醇，混勻，于0℃冰箱內冰浴30min，12000rpm離心10min，棄上清，用0℃預冷的70%乙醇洗滌沉淀2-3次，每次洗滌后，12000rpm離心5min，徹底去上清，所得沉淀即為純化的mtDNA；

?(5)?純化的mtDNA于空氣中自然干燥90-120min（或真空干燥），然后每管加50μl?TE溶液，于室溫下充分溶解60-90min，轉入4℃冰箱中過夜，第二天于恒溫水浴箱中68℃水浴30min或100℃水浴10min以滅活DNase和RNase，分裝后于4℃保存備用或-20℃長期保存。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的mtDNA?COI基因片段的擴增步驟如下：

特異性引物序列如下：

表1???COI基因片段的PCR引物序列??

Table?1???PCR?primer?sequncee?of?every?target?gene?fragment

?

目標基因片段PCR反應體系組成及循環參數見下表2；

表2???COI基因片段?50μl?PCR反應體系的組成

Table?2???Components?of?50μl?PCR?system?for?COI?gene?one

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