[發明專利]一種黃曲霉素B1快速檢測試紙條及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201410208109.4
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN104007255A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 劉博;林親錄;楊濤;羅非君;孫術國;肖華西;汪龍
• 申請（專利權）人: 中南林業科技大學
• 主分類號: G01N33/52
• 分類號: G01N33/52;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所 43205
• 代理人: 寧星耀;許伯嚴

技術領域

本發明涉及一種黃曲霉素B1快速檢測試紙條及其制備方法與應用，尤其是涉及一種黃曲霉素B1膠體金免疫層析快速檢測試紙條及其制備方法與應用。

背景技術

黃曲霉毒素B1(aflatoxin?B1?稱AFB1)是真菌的次級代謝產物，主要是由黃曲霉(Aspergillus?flavus)、寄生曲霉(Aspergillus?parasiticus)和特曲霉(Aspergillus?nomius)產生。它易天然存在于花生、棉籽、玉米、小麥和稻米等農作物中，具有強烈的毒性和致癌性；它是目前化學致癌物中最強的一種致癌誘變劑，其毒性比氰化鉀強10倍，其致癌性比二甲基亞硝胺強75倍。1993年黃曲霉毒素被世界衛生組織(WHO)的癌癥研究機構劃定為Ⅰ類致癌物，其作用的靶器官主要為肝臟。我國國標中規定，大米中的黃曲霉素含量不得高于10μg/kg。

目前，黃曲霉素B1的檢測方法主要有：薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯免疫吸附法(ELISA)。這類方法雖然檢測精度較高，但存在儀器昂貴，檢測成本高，操作不便捷等問題。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，克服現有技術的不足，提供一種黃曲霉素B1快速檢測試紙條及其制備方法與應用，可大規模地對糧食及其加工產品黃曲霉素毒素進行快速、方便的檢測。

本發明解決其技術問題采用的技術方案是：

本發明之黃曲霉素B1快速檢測試紙條，由以下方法制備而成：

（1）抗黃曲霉素B1單抗的制備和純化:

用黃曲霉素B1偶聯牛血清蛋白（AFB1-BSA），混合弗氏不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選出穩定分泌抗鎘離子單克隆抗體的陽性細胞株并擴大培養，注射細胞進小鼠體內誘生腹水；

取2-4?ml黃曲霉毒素B1(AFB1)腹水，加入相當于腹水體積1.8－2.2倍的摩爾濃度為?0.03-0.08?mol/L的pH?4.5-5.5的乙酸緩沖液，用摩爾濃度為0.08-0.12mol/L的HCl調pH?至4.0-5.0，于室溫攪拌下逐滴加入辛酸，所述辛酸的加入量為每毫升稀釋前的腹水加入30－40μl辛酸，攪拌20-40min，2-8℃靜置1-2h，然后在2-8℃下，在8000-12000r/min轉速下離心20-40min，取上清液；上清液經砂芯漏斗過濾后加入相當于上清液體積1/20-1/5的pH為7.0-7.5的磷酸鹽緩沖液（PBS），在2-8℃冷水浴下加入硫酸銨，使硫酸銨的終濃度為0.25-0.30?g/ml（優選濃度為0.277?g/ml），靜置1-2h，2-8℃、8000-12000r/min離心10-20min，棄上清液，將沉淀溶于摩爾濃度為0.008-0.012mol/L的PBS溶液中進行透析：2-8℃靜置過夜，8000-12000r/min離心10-20min，棄沉淀；得上清液抗黃曲霉素B1單抗；?

（2）膠體金溶液的制備：取質量濃度為0.008-0.012%的氯金酸水溶液100ml，攪拌加熱至沸騰，一次性快速加入質量濃度為0.8-1.2%的檸檬酸三鈉水溶液2.0－2.5ml，繼續攪拌加熱0.5-24h，直至溶液呈酒紅色，室溫冷卻，得到含有粒徑為20－40nm的膠體金顆粒的膠體金溶液,膠體金溶液4℃保存；

（3）膠體金標記抗體：取步驟（2）所得膠體金溶液90－110ml，用摩爾濃度為0.2－0.3mol/L的碳酸鉀溶液將其pH值調至8.0－8.5；將步驟（1）所得抗黃曲霉素B1單抗1.6mg加入到膠體金溶液中，攪拌均勻，靜置0.5－24小時（優選2－3小時）；逐滴加入質量濃度為8－12%的無菌牛血清蛋白10－12ml，攪拌0.5－24h，4℃－30℃靜置過夜；將標記后的膠體金溶液于12000－14000r/min離心30－50min，棄上清液，往所得沉淀中加入摩爾濃度為0.01－0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液3－5ml重懸，得到抗黃曲霉素B1單抗標記的膠體金溶液；

（4）噴金：將步驟（3）所得抗黃曲霉素B1單抗標記的膠體金溶液按2－10μl/cm的噴量噴在結合墊上，37℃－45℃抽風烘干，時間為5－24h，得到噴金后的結合墊；