[發明專利]一種黃曲霉素B1快速檢測試紙條及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201410208109.4
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN104007255A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 劉博;林親錄;楊濤;羅非君;孫術國;肖華西;汪龍
• 申請（專利權）人: 中南林業科技大學
• 主分類號: G01N33/52
• 分類號: G01N33/52;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所 43205
• 代理人: 寧星耀;許伯嚴

1.?一種黃曲霉素B1快速檢測試紙條，其特征在于，按照以下方法制備而成：

（1）抗黃曲霉素B1單抗的制備和純化:

用黃曲霉素B1偶聯牛血清蛋白，混合弗氏不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選出穩定分泌抗鎘離子單克隆抗體的陽性細胞株并擴大培養，注射細胞進小鼠體內誘生腹水；

取2-4?ml黃曲霉毒素B1腹水，加入相當于腹水體積1.8－2.2倍的摩爾濃度為?0.03-0.08?mol/L的pH?4.5-5.5的乙酸緩沖液，用摩爾濃度為0.08-0.12mol/L的HCl調pH?至4.0-5.0，于室溫攪拌下逐滴加入辛酸，所述辛酸的加入量為每毫升稀釋前的腹水加入30－40μl辛酸，攪拌20-40min，2-8℃靜置1-2h，然后在2-8℃下，在8000-12000r/min轉速下離心20-40min，取上清液；上清液經砂芯漏斗過濾后加入相當于上清液體積1/20-1/5的pH為7.0-7.5的磷酸鹽緩沖液，在2-8℃冷水浴下加入硫酸銨，使硫酸銨的終濃度為0.25-0.30?g/ml，靜置1-2h，2-8℃、8000-12000r/min離心10-20min，棄上清液，將沉淀溶于摩爾濃度為0.008-0.012mol/L的PBS溶液中進行透析：2-8℃靜置過夜，8000-12000r/min離心10-20min，棄沉淀；得上清液抗黃曲霉素B1單抗；?

（2）膠體金溶液的制備：取質量濃度為0.008-0.012%的氯金酸水溶液100ml，攪拌加熱至沸騰，一次性快速加入質量濃度為0.8-1.2%的檸檬酸三鈉水溶液2.0－2.5ml，繼續攪拌加熱0.5-24h，直至溶液呈酒紅色，室溫冷卻，得到含有粒徑為20－40nm的膠體金顆粒的膠體金溶液,膠體金溶液4℃保存；

（3）膠體金標記抗體：取步驟（2）所得膠體金溶液90－110ml，用摩爾濃度為0.2－0.3mol/L的碳酸鉀溶液將其pH值調至8.0－8.5；將步驟（1）所得抗黃曲霉素B1單抗1.6mg加入到膠體金溶液中，攪拌均勻，靜置0.5－24小時；逐滴加入質量濃度為8－12%的無菌牛血清蛋白10－12ml，攪拌0.5－24h，4℃－30℃靜置過夜；將標記后的膠體金溶液于12000－14000r/min離心30－50min，棄上清液，往所得沉淀中加入摩爾濃度為0.01－0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液3－5ml重懸，得到抗黃曲霉素B1單抗標記的膠體金溶液；

（4）噴金：將步驟（3）所得抗黃曲霉素B1單抗標記的膠體金溶液按2－10μl/cm的噴量噴在結合墊上，37℃－45℃抽風烘干，時間為5－24h，得到噴金后的結合墊；

（5）硝酸纖維素膜上包被C,T線：在硝酸纖維素膜上包被C線和T線，其中C線為質控線，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，濃度為0.2－1.5mg/ml；T線為檢測線，包被偶聯抗原黃曲霉素B1偶聯牛血清蛋白，濃度為0.2-0.5mg/ml；37℃－45℃抽風烘干，時間為2－24h；得到包被后的硝酸纖維素膜；

（6）黃曲霉素B1膠體金免疫層析快速檢測試紙條的組裝：將聚氯乙烯底板、樣品墊、步驟（4）所得噴金后的結合墊、步驟（5）所得包被后的硝酸纖維素膜和吸水紙組裝，切割成條，得到黃曲霉素B1膠體金免疫層析快速檢測試紙條；

組裝方式如下：以聚氯乙烯為底部支撐，將樣品墊，噴金后的結合墊、包被后的硝酸纖維素膜和吸水紙以依次連接的方式粘貼在聚氯乙烯底板上制成；其中樣品墊和吸水紙位于兩端，包被后的硝酸纖維素膜的兩端分別位于結合墊和吸水紙的下面，結合墊的一端設置于樣品墊的下面，另一端設置于包被后的硝酸纖維素膜的上面；

所述包被后的硝酸纖維素膜上設置檢測T線和質控C線，其中檢測線T線靠近樣品墊一端；所述結合墊和樣品墊是將聚酯膜經過混合液浸泡5－24h，取出后于37－45℃抽風烘干得到；所述混合液為摩爾濃度為0.01－0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液，質量體積比為3g－6g/（100ml磷酸鹽緩沖液）的非離子表面活性劑、體積比為1ml－4ml/（100ml磷酸鹽緩沖液）的吐溫20和質量體積比為5g－20g/（100ml磷酸鹽緩沖液）聚乙二醇6000組成的，所述磷酸鹽緩沖液的pH值為7.0－7.5。

2.根據權利要求1所述的黃曲霉素B1快速檢測試紙條，其特征在于，步驟（3）中，將抗黃曲霉素B1單抗1.6mg加入到膠體金溶液中，攪拌均勻，靜置2－3小時。