[發(fā)明專利]高效合成S-腺苷同型半胱氨酸的雙酶體系及其應用方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410207959.2
• 申請日: 2014-05-18
• 公開（公告）號: CN103966185A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設計）人: 邵蔚藍;錢國軍;王洪成
• 申請（專利權(quán)）人: 南京仙奕基因科技有限公司
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12P13/02;C12N15/70;C12N9/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及生物工程領域；具體涉及分子生物技術(shù)、基因工程、酶工程、制藥工程等技術(shù)領域；更具體涉及極耐熱性重組酶的高效表達和酶學定性，以及應用這些酶在高溫下高效生產(chǎn)S-腺苷同型半胱氨酸的方法。

背景技術(shù)

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)是一種氨基酸衍生物，在生物體內(nèi)與抗病性相關，是對相關病理障礙進行早期診斷的重要指標。外源SAH有鎮(zhèn)靜劑作用，是有效的安眠藥和抗驚厥藥物，同時也是1種抗病毒因子。隨著SAH在醫(yī)學領域的廣泛研究與應用，其高效生產(chǎn)制備技術(shù)也備受關注。

SAH可通過化學方法進行合成，但化學合成方法存在生產(chǎn)條件苛刻，污染環(huán)境等缺陷。S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHase）能夠催化腺苷和同型半胱氨酸的合成反應，有效地產(chǎn)生SAH；通過酶法制備SAH可提高生產(chǎn)的可操作性和簡化產(chǎn)物的下游加工過程。但是，已報道的SAHase的活性和穩(wěn)定性都不能滿足生產(chǎn)的要求。

極端嗜熱微生物產(chǎn)生的一類熱穩(wěn)定性酶的高溫酶，在酶的生產(chǎn)和應用過程中克服了中溫酶（20℃-65℃）及低溫酶（2℃-20℃）易于失活的難題，從而極大地降低酶的應用成本，提高生產(chǎn)效率。同時，高溫酶基因在常溫菌細胞內(nèi)重組表達后，可通過熱處理的方式使宿主細胞的蛋白變性，重組酶得到快速分離純化。用高溫酶在較高的溫度下進行生物合成或加工，還有助于提高底物或產(chǎn)物的溶解性，從而加快反應速度、提高產(chǎn)物提取效率。此前，國際上發(fā)表過1篇關于海棲熱袍菌SAHase的研究論文（Lozada-Ramirez et al. 2013, Appl Biochem Biotechnol 170(3): 639-653）。該文作者沒有發(fā)現(xiàn)該酶需要輔酶參與催化反應，所報道的SAHase最高活性只有2.45 U/mg，最適反應條件為75℃，pH 6.5；pH 7.0時酶的活性下降約50%，pH 8.0時活性很低，并且在其設定的反應條件下該酶的穩(wěn)定性極差。

SAHase是一種NAD依賴型酶，在反應過程中需要要消耗大量NAD。由于輔酶的價格高穩(wěn)定性差，并且，隨著輔酶由底物型態(tài)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物型態(tài)，反應方向逐漸逆轉(zhuǎn)，表觀反應速度逐漸停止。因此，輔酶依賴型酶的實際應用，除了必須有合適的酶和反應工藝以外，還需要有效地解決輔酶再生問題。通過雙酶的偶聯(lián)反應，人們有望建立輔酶循環(huán)再生體系，達到降低成本和維持快速反應的目的。本實驗室研究了海棲熱袍菌來源的乳酸脫氫酶的酶學性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該酶具有極高的穩(wěn)定性， 在寬廣的溫度和pH值范圍內(nèi)保持較高活性，在NAD再生中具有很大的應用潛力。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明的目的：

為了解決現(xiàn)有SAH制備方法中酶的活性低，穩(wěn)定性差，NAD消耗快，過程復雜等問題，本發(fā)明研制1種用于合成SAH的高活性的高溫酶，并利用極耐熱性乳酸脫氫酶進行NAD再生，建立高效生產(chǎn)SAH的雙酶體系。

技術(shù)關鍵：

從海棲熱袍菌中克隆出編碼S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脫氫酶的基因并將其分別插入具有自主知識產(chǎn)權(quán)的熱激表達載體pHsh質(zhì)粒（美國專利US 7,807,460 B2），在大腸桿菌中進行超量表達產(chǎn)生極耐熱性S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脫氫酶；對這兩種酶分別進行純化和酶學性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)它們具有很強的活性和匹配性；隨后，運用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脫氫酶建立一個高效的SAH的雙酶合成方法。

技術(shù)方案：

(1) 從海棲熱袍菌中克隆出編碼S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和催化NAD再生反應的酶如乳酸脫氫酶的編碼基因并將其分別插入熱激載體pHsh構(gòu)建表達質(zhì)粒pHsh-sahase，和pHsh-ldh。

(2) 對表達質(zhì)粒中的目標基因的序列進行優(yōu)化，使目標酶在大腸桿菌細胞中實現(xiàn)超量表達；將優(yōu)化后的基因表達質(zhì)粒導入大腸桿菌，通過熱激誘導進行表達。

(3) 對重組的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和催化NAD再生反應的酶如乳酸脫氫酶等進行分離純化（圖1）。

(4) 對分離純化后的各種酶分別進行酶學性質(zhì)的鑒定，（圖2、3）。

(5) 建立用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶制備SAH的單酶合成系統(tǒng)及反應條件。

(6) 以海棲熱袍菌來源的極耐熱性的酶如乳酸脫氫酶等構(gòu)建高效的輔酶再生系統(tǒng)，與S-腺苷同型半胱氨酸水解酶聯(lián)用（圖4），提高SAH的合成速度并延長反應周期（圖5）。

本發(fā)明可取得的有益效果：

本發(fā)明的關鍵有益效果包括：