[發明專利]實時熒光PCR和探針法融解曲線結合的多重核酸檢測方法

有效

• 申請號: 201410206857.9
• 申請日: 2014-05-16
• 公開（公告）號: CN105087763B
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 葉祥忠;吉尚志;付軍;李益民
• 申請（專利權）人: 北京萬泰生物藥業股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 林遠成

本發明屬于生物技術領域，涉及多重核酸檢測探針以及檢測方法，具體涉及一種實時熒光PCR和探針法融解曲線技術相結合的多重核酸檢測探針和檢測方法。本發明還涉及所述探針或方法用于多重核酸檢測的用途。本發明在基于實時熒光PCR技術的反應體系中增加了根據融解曲線反應程序設計的探針，并提供了相應檢測方法，其在同一反應體系內可檢測的樣本數可達到基于實時熒光PCR技術可檢測的樣本數的兩倍。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及多重核酸檢測探針和檢測方法，具體涉及一種實時熒光PCR和探針法融解曲線技術相結合的多重核酸檢測探針和檢測方法。本發明還涉及所述探針或方法用于多重核酸檢測的用途。

背景技術

自實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術發明以來，該技術通過實時監測雜交探針釋放的熒光信號，能夠定性或者定量檢測樣本中的核酸。由于其具備靈敏度高、特異性強、污染少等特點，在核酸檢測領域得到了廣泛的應用。

融解曲線(melting curve)技術主要運用染料法或者探針法對PCR終產物進行定性檢測或者分析。其中，染料法主要通過在PCR終產物中加入飽和或者半飽和染料，該染料能和產物的雙鏈DNA結合并發光，根據產物Tm值不同形成不同的融解峰。探針法融解曲線主要利用熒光標記的探針和PCR終產物進行雜交，探針和產物雜交時會釋放熒光信號；不同熒光基團標記的探針代表不同的檢測項，并且也以探針和產物雜交時的Tm值對應的融解峰判斷陰陽性；探針法融解曲線技術可用于核酸定性檢測，主要應用核酸突變方面的檢測，因為探針的Tm值會隨不同的堿基突變而有所變化，形成不同融解峰，這樣就可以根據融解峰的Tm值的不同具體判斷突位點。

多重熒光PCR技術是指利用實時熒光定量PCR技術、在同一反應體系內用多對引物及探針擴增一種或多種不同擴增子的檢測方法。由于其具備靈敏度高、特異性強、污染少、快捷及節約成本等優點，已成為目前該領域的主要研究及應用熱點。但本技術受到檢測設備通道數目限制，目前的多重熒光定量PCR儀檢測樣本數至多為四個或五個。如果能實現在現有設備通道基礎上擴大檢測樣本數目，那么將能夠進一步節約時間、降低成本、提高效率和擴大應用范圍。

發明內容

本發明通過將實時熒光PCR和探針法融解曲線技術相結合，實現了核酸的實時檢測分析和終點分析相結合，使在同一反應體系內可檢測的樣本數能夠達到基于實時熒光PCR技術可檢測的樣本數的兩倍，由此完成了本發明。

本發明第一方面涉及基于探針法融解曲線技術進行多重核酸檢測的探針，其特征在于該探針不能被DNA聚合酶水解，并且該探針與核酸結合的退火溫度比同一反應體系中實時熒光PCR的探針與核酸結合的退火溫度低3-20℃。

根據本發明第一方面任一項的探針，其中所述核酸為DNA或RNA。

根據本發明第一方面任一項的探針，其中所述DNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性。

根據本發明第一方面任一項的探針，其5’端的五碳糖、堿基或者報告熒光基團被基團修飾，所述基團例如為氨基、硫基、甲基或生物素等。

根據本發明第一方面任一項的探針，所述探針與核酸結合的退火溫度比同一反應體系中熒光PCR探針與核酸結合的退火溫度低5-15℃。

在本發明的實施方案中，所述探針與核酸結合的退火溫度比同一反應體系中實時熒光探針與核酸結合的退火溫度低12℃。

在本發明中，降低探針與核酸結合的退火溫度的方法為本領域所公知，例如，縮短探針的長度、改變核酸的堿基組成或者引入突變位點。

在本發明中，通過引入突變位點降低探針與核酸結合的退火溫度的方法為本領域所公知，例如正常引入一個A/T的突變，Tm值變化在2℃左右，引入一個G/C的突變，Tm值變化在4℃左右。

根據本發明第一方面任一項的探針，所述探針的長度為10-40bp，例如為16-21bp。