[發(fā)明專利]實(shí)時(shí)熒光PCR和探針法融解曲線結(jié)合的多重核酸檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410206857.9
• 申請(qǐng)日: 2014-05-16
• 公開（公告）號(hào): CN105087763B
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葉祥忠;吉尚志;付軍;李益民
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 林遠(yuǎn)成

1.一種檢測(cè)方法，所述方法包括以下步驟：

(1)在基于Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR的基本反應(yīng)體系中，另外加入一種或多種待測(cè)核酸樣本，以及與該待測(cè)核酸樣本對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)融解曲線探針；

(2)同時(shí)設(shè)定Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序以及探針法融解曲線反應(yīng)程序，所述融解曲線反應(yīng)程序的起始溫度與所述融解曲線探針的退火溫度相比，低3-20℃；

(3)反應(yīng)程序結(jié)束后，對(duì)得到的基于Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的擴(kuò)增曲線和基于探針法融解曲線技術(shù)的融解曲線進(jìn)行分析；

其中，所述融解曲線探針與核酸結(jié)合的退火溫度比同一反應(yīng)體系中Taqman實(shí)時(shí)熒光探針與核酸結(jié)合的退火溫度低3-20℃；

并且，所述融解曲線探針不能被具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶水解，所述融解曲線探針的5’端的五碳糖、堿基或者報(bào)告熒光基團(tuán)被基團(tuán)修飾，所述基團(tuán)為氨基、甲基、硫基或生物素；

在步驟(2)中，所述Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序中的退火溫度低于所述Taqman實(shí)時(shí)熒光探針的退火溫度，并且高于所述融解曲線探針的退火溫度。

2.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中，所述融解曲線探針與核酸結(jié)合的退火溫度比同一反應(yīng)體系中Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR中探針與核酸結(jié)合的退火溫度低5-15℃。

3.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中，所述融解曲線反應(yīng)程序的起始溫度與所述融解曲線探針的退火溫度相比低5-15℃。

4.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中，所述融解曲線探針的長度為10-40bp。

5.權(quán)利要求4的檢測(cè)方法，其中，所述融解曲線探針的長度為16-21bp。

6.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中步驟(1)中所述的另外加入的核酸樣本數(shù)或融解曲線探針的個(gè)數(shù)最多與同一反應(yīng)體系中基于Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)可檢測(cè)的樣本或探針數(shù)相同。

7.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中步驟(1)中的融解曲線探針還連接有報(bào)告熒光基團(tuán)，當(dāng)該融解曲線探針的數(shù)目為多個(gè)時(shí)，這些融解曲線探針之間的報(bào)告熒光基團(tuán)不同。

8.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中步驟(1)中還加入與另外加入的核酸樣本相適應(yīng)的擴(kuò)增引物。

9.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中所述的融解反應(yīng)程序?yàn)椋瑥谋人鋈诮馇€探針與核酸的退火溫度低5-15℃開始，逐漸升溫至90-99℃，每秒鐘升溫0.1℃左右。

10.權(quán)利要求9的檢測(cè)方法，其中所述的融解反應(yīng)程序?yàn)椋瑥?0℃開始，逐漸升溫至90-99℃，每秒鐘升溫0.1℃左右。