[發明專利]一種太子參藥材或原植物的快速分子鑒別方法

有效

• 申請號: 201410206387.6
• 申請日: 2014-05-15
• 公開（公告）號: CN104017863A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 周濤;趙丹;江維克;袁媛;肖承鴻
• 申請（專利權）人: 貴陽中醫學院;貴州三泓藥業股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京聯創佳為專利事務所(普通合伙) 11362
• 代理人: 郭防

技術領域

本發明涉及一種中藥材或原植物的真偽鑒別方法，尤其是一種太子參藥材或原植物的快速分子鑒別方法。

背景技術

太子參，石竹科植物孩兒參Pseudostellaria?heterophylla(Miq.)Pax?ex?Pax?et?Hoffm的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤肺的功效，用于脾虛體倦、食欲不振、病后虛弱、氣陰不足、肺燥干咳等癥的治療。作為藥食兩用品種，太子參近年來得到了廣泛的開發與利用。同時為牟取私利，市場上出現了以淡竹葉Lophatherum?gracile.、繁縷Stellaria?media、寶鐸草Disporum?sessile、直立百部Stemona?sessilifolia、百部S.japonica、對葉百部S.tuberosa、禾葉山麥冬Liriope?graminifolia、闊葉山麥冬L.spicata、矮小山麥冬L.minor植物的根或塊根冒充太子參銷售的現象，嚴重危害了消費者的健康。因此對太子參藥材或原植物進行鑒別就顯得尤為重要。

傳統的太子參鑒別主要依靠性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定。但太子參偽品外形與正品外形較為相似，容易混淆，特別是加工粉碎后，藥材飲片特征消失、細胞差別不明顯、理化反應繁鎖等等，一般人難以區分，因此上述鑒別方法均難以真正達到鑒別的目的，針對這種粉末類的、傳統鑒定方法難以準確判定的易混藥材、摻偽藥材，建立一種操作簡捷、結果準確可靠的新型鑒定方法具有重要的現實價值和實踐意義。

DNA分子鑒定方法是一種新型的鑒別方法，其根據基因組序列進行比較研究，在很大程度上彌補和克服了傳統鑒定的缺陷和難題。一般進行DNA分子鑒定的流程是這樣的：根據正品、偽品藥材特定區域的DNA序列(即特異性DNA片段)，設計有高度特異性的正品鑒別引物，利用鑒別引物對所提取樣品的DNA進行PCR擴增，經凝膠電泳檢測鑒別樣品真偽。但是目前由于確定太子參藥材或其原植物的特異性DNA片段存在困難，無法根據特異性DNA片段來設計正品鑒別引物，因而并不能采用分子鑒別的方法來快速鑒別太子參藥材或其原植物。此外，DNA分子鑒定方法中采用凝膠電泳檢測的方法進行鑒別，不僅電泳過程繁瑣、耗時，而且電泳所用的溴化乙錠(EB)試劑污染環境、危害人體的健康。因此探討一種更安全、更靈敏的分子標記檢測方法將有助于特異性PCR鑒定技術的推廣及大規模樣品的鑒定。

發明內容

本發明的目的之一是提供可快速、準確的鑒別太子參藥材或原植物的一段特異性DNA片段及一組引物；

本發明的另外一個目的是提供一種太子參藥材或原植物的快速分子鑒別方法。

為解決上述技術問題，本發明采用如下的技術方案：太子參藥材或原植物快速分子鑒別的特異性DNA片段，其序列如序列表中序列1所示。序列表中序列1為太子參藥材或原植物的rDNA-ITS2核苷酸序列的一個片段。

太子參藥材或原植物快速分子鑒別的一組引物，該組引物由序列表中序列1所示序列設計合成，其序列如序列表中序列2和序列3所示。

權利要求2所述的引物在太子參藥材或原植物的快速分子鑒別中的應用。

包括權利要求2所述引物的試劑盒。

太子參藥材或原植物的快速分子鑒別方法，包括以下步驟：利用序列為序列2和序列3所示的引物對鑒別樣品進行PCR反應；PCR反應產物中加入SYBR?Green?I核酸熒光染料，混勻后在紫外光下觀察，PCR反應產物產生綠色熒光的樣品即為太子參藥材或原植物，PCR反應產物未產生綠色熒光的樣品即為其它植物材料。

優選的，所述的對鑒別樣品進行PCR反應包括：提取鑒別樣品的基因組DNA，用該基因組DNA作為模板，利用序列為序列2和序列3所示的引物進行PCR反應。

更優選的，所述的提取鑒別樣品的基因組DNA具體包括以下步驟：取鑒別樣品1～5mg，用植物DNA提取試劑盒、CTAB提取法或堿裂解法提取基因組DNA。

前述的太子參藥材或原植物的快速分子鑒別方法中，所述的PCR反應體系為25μL，反應液組成為：Taq酶預混液5～13μL，上游和下游引物各為10～25pmol，DNA模板20～150ng，滅菌重蒸水加至25μL；反應程序為：93～96℃預變性1～5min，93～96℃變性5～30s，52～64℃退火延伸15～40s，變性、退火延伸共進行30～40次循環；最后71～73℃后延伸1～5min；PCR產物的檢測：PCR反應產物中加入1～5μL100×SYBR?Green?I核酸熒光染料，混勻后在300～400nm紫外光下觀察。