[發明專利]一種高效液相色譜法測定艾塞那肽及其雜質的方法

有效

• 申請號: 201410205748.5
• 申請日: 2014-05-14
• 公開（公告）號: CN103995062A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 彭忠華
• 申請（專利權）人: 浙江圣兆醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬分析化學領域，涉及分析檢測艾塞那肽及其雜質的方法，特別涉及用一種高效液相色譜法有效分離并測定艾塞那肽及其雜質的方法。?

背景技術

????在艾塞那肽合成、放置、制劑工藝過程中，會產生某些與艾塞那肽結構和性質類似的雜肽（即艾塞那肽雜質），例如缺失肽、非對映異構體等。目前，分離艾塞那肽及其雜質的方法常為反相高效液相色譜法和離子交換色譜法，但這些現公開的反相高效液相色譜法（流動相系乙腈：0.1%三氟乙酸溶液等）方法在艾塞那肽及其雜質測定過程中，專屬性差，使得艾塞那肽及其雜質（Exenatide?fragment3-39、Acetyl?Exenatide、L-Glu¹³?Exenatide、D-Ser⁸?Exenatide、D-Ser¹¹?Exenatide、Met[O]?Exenatide、D-His¹?Exenatide、?Des-Gly²?Exenatide）的峰不能分離或分離度達不到要求。?

發明內容

????本發明的目的是提供一種高效液相色譜法測定艾塞那肽及其雜質的方法，旨在解決艾塞那肽及其雜質（Exenatide?fragment3-39、Acetyl?Exenatide、L-Glu¹³?Exenatide、D-Ser⁸?Exenatide、D-Ser¹¹?Exenatide、Met[O]?Exenatide、D-His¹?Exenatide、?Des-Gly²?Exenatide）的分離并定量測定。

本發明通過以下步驟實現：

1、色譜柱的準備:所用色譜柱的填充劑為用辛烷基硅烷；

2、高效液相色譜儀的設置：檢測器的檢測波長為214nm，自動進樣器溫度為6℃，柱溫為40℃，流動相流速為0.8~1.2ml/min；

3、色譜流動相水相的配置：稱取烷基磺酸鈉（庚烷磺酸鈉、戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、壬烷磺酸鈉、癸烷磺酸鈉）適量，用水溶解并稀釋成濃度總和為1.2~1.8mmol/L溶液，并用磷酸調pH至4.0~4.8；

所述的烷基磺酸鈉可以是庚烷磺酸鈉、戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、壬烷磺酸鈉、癸烷磺酸鈉任意一種或多種的混合物；

所述的烷基磺酸鈉的濃度可以是庚烷磺酸鈉、戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、壬烷磺酸鈉、癸烷磺酸鈉一種或多種的混合物的濃度總和；?

4、流動相的準備：以乙腈-上述烷基磺酸鈉溶液(?10:90?)為流動相A，乙腈-上述烷基磺酸鈉溶液（?52:48）為流動相B；

5、采用梯度洗脫，洗脫時間及流動相A體積比程序為0.01～60?min從60％→25％、60～60.5min?再從25％→60％、60％運行至65min；?

6、樣品溶液的配置：精密稱取樣品適量，用流動相溶解并稀釋至每ml約含艾塞那肽0.4~1.6mg/ml溶液；

7、精密吸取樣品溶液40μl，注入液相色譜儀測定，并記錄色譜圖，在得到的色譜圖中，各雜質與主峰均達到良好分離，艾塞那肽的保留時間為26.272min，各雜質Exenatide?fragment3-39、Acetyl?Exenatide、L-Glu¹³?Exenatide、D-Ser⁸?Exenatide、D-Ser¹¹?Exenatide、Met[O]?Exenatide、D-His¹?Exenatide、?Des-Gly²?Exenatide的保留時間分別為：8.787min、10.935min、12.109min、13.085min、23.204min、24.855min、28.458min、29.407min，相對保留時間分別為：0.33、0.42、0.46、0.50、0.88、0.95、1.08、1.12。?

本發明通過合理的方法設計，與現有的方法技術相比，具有明顯的優點：使分離的已結構確證的雜質達到8個；各雜質的專屬性、線性及范圍、回收率、精密度、耐用性等試驗均良好；儀器設備為已普及的高效液相色譜儀；且流動相配制簡單、檢測成本低等。

附圖說明

?圖1是艾塞那肽與各雜質液相分離圖。

具體實施方式