[發明專利]用于生產異丁香酚單加氧酶的大腸埃希氏菌及構建和應用

有效

• 申請號: 201410204528.0
• 申請日: 2014-05-14
• 公開（公告）號: CN104031873B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 趙麗青;馬田田;吳序櫟;李小曼;宋江寧
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/02;C12P7/24;C12R1/19
• 代理公司: 深圳新創友知識產權代理有限公司44223
• 代理人: 劉莉

技術領域

本發明涉及異丁香酚單加氧酶的基因工程菌的構建及其生物催化技術領域，特別是涉及一種用于生產異丁香酚單加氧酶的大腸埃希氏菌及構建方法和應用。

背景技術

香草醛是工業中應用最廣泛的香料之一，大量用于食品工業，可作為香氣修飾和定香的主要原料用于食品、牙膏、香皂、煙草中；在醫藥化工中作為重要的原料或中間體，可用于制造治療高血壓、心臟病、皮膚病及消除口臭、利尿的常用藥物；在化學工業中可作為化學助劑，用于塑料制品的抗硬化劑以及Ni，Cr，Cd等金屬的電鍍光亮劑；在農業生產上，香草醛可作為作物增產劑和催熟劑，并用之制備除草劑和昆蟲引誘劑等，需求量很大。香草醛目前主要由化學方法制備，但用化學合成法制得的香草醛不是天然香料。天然香草醛可以從香子蘭的花莢中提取，但用植物組織提取的方法生產的天然香草醛量少而價高，不能滿足日益增長的需求。

隨著世界各國對食品安全越來越重視，對天然香草醛的需求越來越大。天然香料是指由動植物材料經物理(包括蒸餾、溶劑萃取)方法、酶法或微生物方法得到的，可通過傳統的食品加工方法(包括干燥、焙烤、發酵)加工后用于人類消費的物質。根據歐洲和美國立法，利用動植物資源通過物理方法、酶法或微生物法得到的物質才能稱為天然物質(Muheim Andrea.US6,235,507.2001)。用生物法生產的香草醛，屬天然產品，可以生物降解，符合消費者追求天然產品的消費心理。因此，利用生物轉化技術生產生物香蘭素，是一種有效的、很有前途的替代方法。

在過去的十年里報道了許多用微生物法或酶法生產香草醛的方法，一般都是通過微生物或酶將合適的前體轉化為香草醛。目前，尚未有重組菌轉化異丁香酚生產香草醛的任何報道。

發明內容

為了彌補上述現有技術的不足，本發明提供一種用于生產異丁香酚單加氧酶的工程菌(大腸埃希氏菌)及其構建方法和應用，該工程菌可用于生產異丁香酚單加氧酶，進而用于轉化異丁香酚生產香草醛。

本發明的技術問題通過以下的技術方案予以解決：

一種用于生產異丁香酚單加氧酶的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，該所述大腸埃希氏菌命名為BL21(DE3)IEM-PP，保藏編號為CGMCC No.8918。

本發明提供的工程菌屬于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，命名為BL21(DE3)IEM-PP，已于2014年3月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC No.8918。大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)IEM-PP CGMCC No.8918簡稱大腸埃希氏菌BL21(DE3)IEM-PP。該大腸埃希氏菌BL21(DE3)IEM-PP可用于生產異丁香酚單加氧酶，并利用其轉化異丁香酚生產香草醛。

一種上述大腸埃希氏菌的構建方法，包括如下步驟：

(1)提取土壤的全基因組DNA；

(2)根據異丁香酚單加氧酶的基因序列，設計PCR引物，所述PCR引物包括上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；

(3)以所述全基因組DNA為模板，用步驟(2)中的PCR引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，切膠回收得到大小為1438bp的目標基因SEQ ID NO.3；

(4)將目標基因SEQ ID NO.3插入T載體pET21(a)的Ndel和XhoI酶切位點之間，得到重組質粒PET21(a)-IEM；

(5)將重組質粒PET21(a)-IEM轉化得到所述大腸埃希氏菌。

一種所述的大腸埃希氏菌在生產異丁香酚單加氧酶中的應用。

優選地，所述的應用包括如下步驟：

(1)將所述的大腸埃希氏菌接種至發酵培養基，得到菌濃度OD_600nm＝0.1-0.2(如0.1-0.15或0.15-0.2)的發酵初始體系；

(2)將所述發酵初始體系進行如下發酵：先在35-37℃下振蕩培養3-5小時，然后加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)至IPTG在所述述發酵初始體系中的終濃度為50-100μM，然后在25-30℃下繼續振蕩培養12-48小時，得到氨基酸序列為SEQ ID No.4異丁香酚單加氧酶。