[發明專利]用于生產異丁香酚單加氧酶的大腸埃希氏菌及構建和應用

有效

• 申請號: 201410204528.0
• 申請日: 2014-05-14
• 公開（公告）號: CN104031873B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 趙麗青;馬田田;吳序櫟;李小曼;宋江寧
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/02;C12P7/24;C12R1/19
• 代理公司: 深圳新創友知識產權代理有限公司44223
• 代理人: 劉莉

1.一種香草醛的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：按異丁香酚:異丁香酚單加氧酶:緩沖液＝0.1～0.4g:0.2～1.2g:9～18mL加入反應容器中，在20～28℃下振搖轉化12～48h，得到香草醛；所述緩沖液為pH8～10.4的甘氨酸/NaOH水溶液；

在所述反應容器中，添加香草醛吸附劑；每0.1～0.4g異丁香酚中：香草醛吸附劑的加入量≤0.6g，所述香草醛吸附劑是殼聚糖膜。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述異丁香酚單加氧酶是由大腸埃希氏菌發酵得到，所述大腸埃希氏菌命名為BL21(DE3)IEM-PP，保藏編號為CGMCC No.8918，包括如下步驟：

(1)將大腸埃希氏菌接種至發酵培養基，得到菌濃度OD_600nm＝0.1-0.2的發酵初始體系；

(2)將所述發酵初始體系進行如下發酵：先在35-37℃下振蕩培養3-5小時，然后加入IPTG至IPTG在所述述發酵初始體系中的終濃度為50-100μM，然后在25-30℃下繼續振蕩培養12-48小時，得到異丁香酚單加氧酶。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述發酵培養基pH為7.0-7.2，包括10-15g/L胰蛋白胨、15-23g/L酵母提取物、5-10g/L氯化鈉、10-15g/L甘油、10-17mM磷酸二氫鉀和65-75mM磷酸氫二鉀，余量為水。

4.如權利要求2或3所述的制備方法，其特征在于：所述大腸埃希氏菌以種子液的形式用移液器接種至所述發酵培養基，所述種子液占所述發酵培養基的體積分數為0.5-2％，所述種子液是將所述大腸埃希氏菌接種至種子培養基，35-37℃振蕩培養至菌濃度OD_600nm＝3-6形成。

5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述種子培養基pH為7.0-7.2，包括10-15g/L胰蛋白胨、5-8g/L酵母提取物、5-10g/L氯化鈉、余量為水。

6.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述的大腸埃希氏菌的構建方法包括如下步驟：

(1)提取土壤的全基因組DNA；

(2)根據異丁香酚單加氧酶的基因序列，設計PCR引物，所述PCR引物包括上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；

(3)以所述全基因組DNA為模板，用步驟(2)中的PCR引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，切膠回收得到大小為1438bp的目標基因SEQ ID NO.3；

(4)將目標基因SEQ ID NO.3插入T載體pET21(a)的Ndel和XhoI酶切位點之間，得到重組質粒PET21(a)-IEM；

(5)將重組質粒PET21(a)-IEM轉化得到所述大腸埃希氏菌。